環(huán)境生物學(xué)第七章第三節(jié)

7.3細(xì)胞工程與環(huán)境污染生物治理7.3.1細(xì)胞工程概述細(xì)胞工程(CellEngineering)的定義

在細(xì)胞水平上（細(xì)胞增殖、分化、死亡）研究、開(kāi)發(fā)和利用各類細(xì)胞的工程。細(xì)胞工程的發(fā)展主要建立在細(xì)胞融合（cellfusion）的基礎(chǔ)上，人們可以根據(jù)需要，經(jīng)過(guò)科學(xué)設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上改造生物的遺傳物質(zhì)。它所要求的技術(shù)條件、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑、經(jīng)費(fèi)等均比基因工程要求的低一些。37℃40min促融劑人細(xì)胞小鼠細(xì)胞紅色熒光染料標(biāo)記的膜蛋白氯色熒光染料標(biāo)記的膜蛋白融合細(xì)胞細(xì)胞工程的主要方法⊙細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）

將細(xì)胞從生物體內(nèi)取出，然后在特制的培養(yǎng)容器內(nèi)給予必要的生長(zhǎng)條件，使其在體外（invitro）繼續(xù)生長(zhǎng)與繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)有動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、植物的花粉、原生質(zhì)體的培養(yǎng)。幼齡動(dòng)物剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)⊙細(xì)胞融合（cellfusion）

在一定的條件下，將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程，細(xì)胞融合又稱細(xì)胞雜交。基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱為同核體；來(lái)自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體。細(xì)胞的融合過(guò)程，最初是細(xì)胞在促融因子作用下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，細(xì)胞之間的質(zhì)膜發(fā)生粘連，細(xì)胞質(zhì)開(kāi)始融合，然后在培養(yǎng)過(guò)程中，進(jìn)而發(fā)生核融合，形成雜種細(xì)胞?！鸭?xì)胞重組

在體外條件下，運(yùn)用試驗(yàn)技術(shù)從活細(xì)胞中分離出各種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或組件，再根據(jù)需要把它們?cè)诓煌募?xì)胞之間重新進(jìn)行裝配，成為具有生物活性的細(xì)胞。重組有核移植和細(xì)胞器移植：①

核移植——

主要是借助顯微操作儀，在顯微鏡下用微吸管把一個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞核吸出，直接移到另一個(gè)去核的細(xì)胞中。②

細(xì)胞器移植——

通過(guò)原生質(zhì)體對(duì)已分離純化的葉綠體的胞飲作用，進(jìn)行葉綠體移植，或通過(guò)微注射、載體轉(zhuǎn)移以及胞飲攝入進(jìn)行線粒體移植。顯微操作儀⊙遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移——基因在細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)移①

載體法——

利用雙子葉植物如番茄、甜菜、棉花和大豆等常用載體轉(zhuǎn)移基因的方法，將含有外源基因的根瘤農(nóng)桿菌與受體原生質(zhì)體共同培養(yǎng)，或?qū)⒑型庠椿虻馁|(zhì)粒和受體原生質(zhì)體用聚乙二醇（PEG）處理轉(zhuǎn)化，最后由轉(zhuǎn)化體培育成轉(zhuǎn)化植物。②

直接導(dǎo)入法——

最常用的是微注射法，即在顯微操作儀的幫助下，用微針直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行注射，直接將外源基因注入到一個(gè)受體的受精卵的核內(nèi)，然后合子便能發(fā)育成胚，并進(jìn)一步發(fā)育成為成熟的個(gè)體。細(xì)胞工程的內(nèi)容

包括微生物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程，目前主要應(yīng)用微生物細(xì)胞工程進(jìn)行污染生物治理?！盐⑸锛?xì)胞工程

微生物細(xì)胞工程應(yīng)用微生物進(jìn)行細(xì)胞水平的研究和生產(chǎn)，具體內(nèi)容包括各種微生物細(xì)胞的培養(yǎng)（發(fā)酵工程）、遺傳性狀的改造（遺傳學(xué)、發(fā)酵工程、基因工程）、微生物細(xì)胞的直接利用或獲得細(xì)胞代謝產(chǎn)物等。其中微生物細(xì)胞原生質(zhì)體融合技術(shù)是構(gòu)建環(huán)境工程菌的基本技術(shù)?！镂⑸锛?xì)胞原生質(zhì)體融合技術(shù)——

首先經(jīng)培養(yǎng)獲得大量菌體細(xì)胞，用脫壁酶處理脫壁，制成原生質(zhì)體。然后將兩種不同菌株的原生質(zhì)體混合在一起，使原生質(zhì)體彼此接觸、融合，再使融合的原生質(zhì)體在合適的培養(yǎng)基平板上再生出細(xì)胞壁，并生長(zhǎng)繁殖，形成菌落，最后測(cè)定參與融合的性狀重組或產(chǎn)量變化情況，以篩選出重組子。微生物細(xì)胞原生質(zhì)體融合的關(guān)鍵步驟：①原生質(zhì)體制備→

原生質(zhì)體（Protoplast）：細(xì)胞質(zhì)壁分離后去掉細(xì)胞壁所余下那部分結(jié)構(gòu)。原生質(zhì)體具備原有細(xì)胞的全部?jī)?nèi)部結(jié)構(gòu)與生理性能，但是它完全無(wú)細(xì)胞壁，失去了細(xì)胞的剛性而呈球形，對(duì)滲透壓十分敏感。原生質(zhì)體比較容易吸收外來(lái)的DNA、蛋白質(zhì)等，同時(shí)，對(duì)外界理化因子比較敏感，在原生質(zhì)體外面僅存原生質(zhì)膜，在外界理化融合因子的誘導(dǎo)下，不同物種間的原生質(zhì)體間的質(zhì)膜相互融合雜交，并在適當(dāng)?shù)臈l件下，融合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁并恢復(fù)原來(lái)完整的細(xì)胞形態(tài)與群落形態(tài)，構(gòu)成具有多種遺傳性狀的新物種。

脫壁：為了進(jìn)行細(xì)胞融合，必須先除去細(xì)胞壁。目前常用的方法是酶解法（主要采用溶菌酶、纖維素酶等）。②融合重組→

把兩親株的原生質(zhì)體混合在一起，促進(jìn)融合，然后將融合液涂布在平板上再生，檢出重組子。融合重組示意圖細(xì)胞壁溶菌酶細(xì)胞膜生長(zhǎng)細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)融合的原生質(zhì)體混合融合子原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合細(xì)胞壁再生誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法——化學(xué)誘導(dǎo)法：常用于細(xì)胞融合的化學(xué)促融劑是聚乙二醇（PEG），方法是：在得到兩親本原生質(zhì)體后，等量混合兩親本的原生質(zhì)體，加入適量的PEG和鈣離子溶液，保溫后，洗去多余的PEG，在選擇培養(yǎng)基上篩選出融合子。——電融合法：借助電場(chǎng)的作用，引發(fā)細(xì)胞融合。③原生質(zhì)體再生成細(xì)胞→

原生質(zhì)體在等滲的培養(yǎng)基中重建細(xì)胞壁，恢復(fù)細(xì)胞完整形態(tài)，并能生長(zhǎng)、分裂。④融合重組的測(cè)定→

通常采用染色體標(biāo)記的遺傳重組體來(lái)檢測(cè)。7.3.2應(yīng)用舉例—利用原生質(zhì)體融合構(gòu)建環(huán)境工程菌芳香族化合物降解菌的構(gòu)建PseudomonasalcaligenesCO可降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯，但不能利用甲苯和1,4-二氯苯甲酸酯PseudomonasputidaR5-3可以降解苯甲酸酯和甲苯，但不能利用3-氯苯甲酸酯和1,4-二氯苯甲酸酯融合子CB1-9可以同時(shí)降解上述4種化學(xué)污染物假單胞菌乙二醇降解菌：Pseudomonasmendocina3RE-15甲醇降解菌：Bacilluslentus

3RM-2苯甲酸和苯降解菌AcinetobactercalcoaceticusT3的原生質(zhì)體融合菌株TEM-1可同時(shí)降解苯甲酸、苯、甲醇和乙二醇DNADNA融合纖維素降解菌的構(gòu)建脫氫雙香草醛（DDV）降解菌Fusobacteriumvarium對(duì)DDV的降解能力為3-10%脫氫雙香草醛降解菌Enterococcusfaecium對(duì)DDV的降解能力為3-10%融合細(xì)胞FE7菌株DDV降解率高達(dá)80%融合聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合制備細(xì)菌殺蟲(chóng)劑玉米螟球形芽孢桿菌BacillussphaericusTS-1：殺：淡色庫(kù)蚊（雙翅目）蘇云金芽孢桿菌Bacillus