序列分析軟件的使用方法

序列分析軟件的使用方法第一頁，共五十三頁，2022年，8月28日DNAMAN是一種常用的核酸序列分析軟件。由于它功能強大，使用方便，已成為一種普遍使用的DNA序列分析工具。

第二頁，共五十三頁，2022年，8月28日打開DNAMAN，可以看到如下界面：

第一欄為主菜單欄。除了幫助菜單外，有十個常用主菜單，第二欄為工具欄：第三欄為瀏覽器欄：在瀏覽器欄下方的工作區(qū)左側，可見Channel工具條，DNAMAN提供20個Channel，點擊Channel工具條上相應的數(shù)字，即可擊活相應的Channel。每個Channel可以裝入一個序列。將要分析的序列（DNA序列或氨基酸序列）放入Channel中可以節(jié)約存取序列時間，加快分析速度。第三頁，共五十三頁，2022年，8月28日第四頁，共五十三頁，2022年，8月28日如何使用DNAMAN分析序列

1．將待分析序列裝入Channel通過FileOpen命令打開待分析序列文件，則打開的序列自動裝入默認Channel。通過Sequence/LoadSequence菜單的子菜單打開文件或將選定的部分序列裝入Channel。通過Sequence/CurrentSequence/AnalysisDefination命令打開一個對話框，通過此對話框可以設定序列的性質（DNA或蛋白質），名稱，要分析的片段等參數(shù)。第五頁，共五十三頁，2022年，8月28日2．以不同形式顯示序列

通過Sequence//DisplaySequence命令打開對話框，根據(jù)不同的需要，可以選擇顯示不同的序列轉換形式。對話框選項說明如下：Sequence&Composition顯示序列和成分第六頁，共五十三頁，2022年，8月28日2．以不同形式顯示序列ReverseComplementSequence顯示待分析序列的反向互補序列ReverseSequence顯示待分析序列的反向序列ComplementSequence顯示待分析序列的互補序列DoubleStrandedSequence顯示待分析序列的雙鏈序列RNASequence顯示待分析序列的對應RNA序列第七頁，共五十三頁，2022年，8月28日3．DNA序列的限制性酶切位點分析將待分析的序列裝入Channel，點擊要分析的Channel，然后通過Restriction/Analysis命令打開對話框，參數(shù)說明如下：Results分析結果顯示其中包括：Showsummary（顯示概要）Showsitesonsequence（在結果中顯示酶切位點）Drawrestrictionmap（顯示限制性酶切圖）Drawrestrictionpattern（顯示限制性酶切模式圖）

第八頁，共五十三頁，2022年，8月28日3．DNA序列的限制性酶切位點分析Ignoreenzymeswithmorethan（忽略大于某設定值的酶切位點）Ignoreenzymeswithlessthan（忽略小于某設定值的酶切位點）TargetDNA（目標DNA特性）Circular（環(huán)型DNA），dam/dcmmethylation（dam/dcm甲基化）allDNAinSequenceChannel（選擇此項，在SequenceChannel中的所有序列將被分析，如果選擇了Drawrestrictionpattern，那么當所有的channel中共有兩條DNA時，則只能選擇兩個酶分析，如果共有三個以上DNA時，則只能用一個酶分析。）第九頁，共五十三頁，2022年，8月28日選擇所需的項目，然后按提示操作點擊按扭，出現(xiàn)下列對話框：參數(shù)說明如下：Enzyme代表（enzymedatafile），點擊旁邊的下拉按鈕，出現(xiàn)兩個默認選項，restrict.enz和dnamane.enz，如果添加過自制的酶列表，則附加顯示自制酶列表文件名。其中restrict.enz數(shù)據(jù)文件包含180種限制酶，dnamane.enz數(shù)據(jù)文件包含2524種限制酶。選擇其中一個數(shù)據(jù)文件，相應的酶在左邊的顯示框中列出（按酶名稱字母表順序），鼠標雙擊酶名稱，則對應的酶被選中，在右邊空白框中列出。第十頁，共五十三頁，2022年，8月28日要自制酶切列表，可以從左邊酶列表中雙擊鼠標選擇多種酶（例如puc18multiplecloningsites），然后點擊按鈕出現(xiàn)下列對話框：輸入要保存酶列表的文件名，點擊按鈕即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切位點。Cutter酶切識別序列長度；End酶切產(chǎn)生的末端，其中包括，Blunt（平頭末端），5’Overhang（5’突出粘性末端）,3’Overhang(3’突出粘性末端)，系統(tǒng)根據(jù)cutter和end的設定情況,在左邊酶列表中顯示符合條件的酶。最后，點擊按鈕執(zhí)行操作。第十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日4．DNA序列比對分析

（DotMatrixComparision）要比較兩個序列，可以使用DNAMAN提供的序列比對工具DotMatrixComparision（點矩陣比較）通過Sequense/Dotmatrixcomparision命令打開比對界面，點擊對比界面左上角的按鈕，出現(xiàn)下列對話框：第十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日參數(shù)說明如下：Sequencetype序列類型Sequence1參加比對的第一序列選擇框，框內選項說明如下：如果要比對的序列在Channel中，點擊下拉箭頭，選擇相應的Channel，則被選中的Channel中的序列作為參加比對的第一序列；也可以從文件夾中選擇參加比對的序列，在File選擇框上點擊即可。通過Length選擇參加比對的序列片段。Sequence2參加比對的第二序列選擇框；選項說明同上ShowSequence選擇此項，當同源性大于設定值時，將顯示同源性；第十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日Annotations是否顯示注釋Comparision比對參數(shù)，其中Window代表Windowsize（單位比對長度），Mismatch代表Mismatchsize（單位比對長度中許可的錯配值）要快速比對，需將此項設為0。Bothstran代表Bothstrand（雙鏈比對）選擇此項，是指用Sequence2中的序列的正鏈和負鏈分別和Sequence1比較。Sequence2正鏈與Sequence1比較結果用黑色點表示，Sequence2負鏈比對結果用紅色點表示。

第十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日Plotbox點陣圖表顯示參數(shù)，Position（起點坐標）Width（寬度值）Height（高度值）Framesize（邊框線粗度值）Dotsize（點粗度值）Gridline（虛線框數(shù)）。參數(shù)設定好后，點擊按鈕執(zhí)行操作。第十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日5．序列同源性分析（1）兩序列同源性分析通過Sequence/TwoSequenceAlignment命令打開對話框，如下所示：參數(shù)說明如下：Alignmentmethod比對方法，通?？蛇xQuick(快速比對)或Smith&Waterman(最佳比對)，當選擇快速比對時，設置較小的k-tuple值，可以提高精確度，當序列較長時，一般要設置較大的k-tuple值。k-tuple值可選范圍2—6；蛋白質序列：k-tuple值可選范圍1—3。

第十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日（2）多序列同源性分析通過打開Sequence/MultipleSequenceAlignment命令打開對話框，參數(shù)說明如下：File從文件中選擇參加比對的序列Folder從文件夾中選擇參加比對的序列Channel從channel中選擇參加比對的序列Dbase從數(shù)據(jù)庫中選擇參加比對的序列Remove清除選擇的序列（鼠標點擊左邊顯示框中的序列名選擇）Clear清除全部序列

第十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日點擊按鈕，出現(xiàn)方法選擇對話框：選擇其中一種方法，點擊按鈕，出現(xiàn)下列對話框：如果在前一對話框選擇的是Fastalignment,則在此對話框中選擇Quickalignment,否則選擇Dynamicalignment即可。其它參數(shù)不必改變，點擊對話框中間的使其它參數(shù)取原始默認值。

點擊左上角按鈕，可以從彈出的對話框中選擇不同的結果顯示特性選項。點擊按鈕下的按鈕，出現(xiàn)下列選擇項：

可以通過這些選項，繪制同源關系圖（例如Tree/homologytree命令）。顯示蛋白質二級結構（ProteinSecondaryStructure命令），繪制限制性酶切圖（RestrictionAnalysis命令）等。第十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日6.PCR引物設計首先，將目標DNA片段裝入Channel,并激活Channel。點擊主菜單欄中的Primer主菜單，出現(xiàn)下拉菜單，點擊DesignPCRPrimersforDNA命令，出現(xiàn)下列對話框：

參數(shù)說明如下：Primerlocationsontarget引物定位其中包括下列選項：Productsize（擴增目的片段大?。㏒enseprimer(正向引物選擇區(qū))

Antisenseprimer(反向引物選擇區(qū))Primer引物特性包括Length(引物長度)，Tm值,GC含量等參數(shù)；Rejectprimer引物過濾（將符合引物過濾條件的引物過濾掉）第十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日包括下列選項：3’dimer(可形成3’端自我互補的堿基數(shù))Hairpinstem(可形成發(fā)卡頸環(huán)結構的堿基數(shù))PolyN(多聚堿基)3’Uique(3’端嚴格配對堿基數(shù))Allmatches(引物互補配對百分數(shù))Consentrations濃度設定ProductforhybridyzatPCR產(chǎn)物用于SouthernBlot探針雜交

第二十頁，共五十三頁，2022年，8月28日7．畫質粒模式圖我們常常要用到各種質粒圖，無論是制作幻燈片，還是發(fā)表文章，常常需要質粒圖。DNAMAN提供強大的繪質粒圖功能，能滿足我們的需要。通過Restriction/Drawmap命令打開質粒繪圖界面：

將鼠標移動到圓圈上，等鼠標變形成“I”時，單擊鼠標左鍵，出現(xiàn)如下菜單：菜單說明如下：Position當前位置AddSite添加酶切位點AddElement添加要素AddText添加文字InsertFragment插入片斷CopyFragment復制片斷CutFragment剪切片斷RemoveFragment清除片斷FrameThickness邊框線粗細調節(jié)

第二十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日點擊AddSite選項，出現(xiàn)對話框：參數(shù)說明如下：Name要添加的酶切位點的名稱(例如HindIII)Position位置（以堿基數(shù)表示）點擊AddElement選項，出現(xiàn)如下對話框：

參數(shù)說明如下：Type要素類型（共有三種類型，鼠標點擊即可切換）Color/Pattern填充色（共有16種顏色供選擇）Name要素名稱Start/End/Size要素起點/終點/粗細度

第二十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日核酸序列的一般分析流程

第二十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日1.1核酸序列的檢索

:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide

1.2核酸序列的同源性分析1.2.1基于NCBI/Blast軟件的核酸序列同源性分析

1.2.2核酸序列的兩兩比較

1.2.3核酸序列的批量聯(lián)網(wǎng)同源性分析(方案)第二十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日1.3核酸序列的電子延伸

1.3.1利用UniGene數(shù)據(jù)庫進行電子延伸(方案)1.3.2利用Tigem的ESTMachine進行電子延伸

ESTExtractor:|

ESTAssembly:http://www.tigem/ESTmachine.html

1.3.3利用THC數(shù)據(jù)庫對核酸序列進行電子延伸

第二十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日1.4核酸序列的開放閱讀框架分析

基于NCBI/ORFfinder的ORF分析

1.5基因的電子表達譜分析1.5.1利用UniGene數(shù)據(jù)庫進行電子表達譜分析（方案）利用Tigem的電子原位雜交服務器進行電子表達譜分析

第二十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日1.6核酸序列的電子基因定位分析

1.6.1利用STS數(shù)據(jù)庫進行電子基因定位

1.6.2利用UniGene數(shù)據(jù)庫進行電子基因定位（方案）第二十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日1.7cDNA的基因組序列分析

1.7.1通過從NCBI查詢部分基因組數(shù)據(jù)庫進行基因組序列的分析(方案)

1.7.2通過從NCBI查詢全部基因組數(shù)據(jù)庫進行基因組序列的分析

1.7.3通過從SangerCentre查詢基因組數(shù)據(jù)庫進行基因組序列的分析

第二十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日1.8基因組序列的初步分析

1.8.1基因組序列的內含子/外顯子分析

1.8.2基因組序列的啟動子分析

第二十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日1.9核酸序列的注冊

1.9.1EST序列的注冊(方案)

1.9.2較長或全長cDNA序列的注冊(方案)1.10待分析序列所對應的已知克隆的獲取

第三十頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物設計引物引物的重要性引物設計的原則引物與PCR引物設計軟件如何使用PrimerPremier5.0引物同源性分析第三十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補。→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer第三十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物的重要性在整個PCR體系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的DNA結合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。第三十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物設計原則引物長度堿基分布的均衡性Tm值引物二級結構引物3’端引物5’端引物的內部穩(wěn)定性引物的保守性與特異性擴增區(qū)域的二級結構第三十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物長度一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時應使用較長的引物，但最多不超過50個核苷酸。第三十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日堿基分布的均衡性同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應超過5個GC含量一般40-60%GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。第三十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物Tm值一般要求：55℃-65℃。計算：對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設計軟件最常用的計算方式。Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15

第三十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物二級結構引物二聚體盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補發(fā)夾結構尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結構，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。第三十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物3’端引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增完全失敗?？紤]到密碼子的簡并性，引物3’端最后一個堿基最好不與密碼子第三個堿基配對。第三十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。5’端加上限制性核酸內切酶位點序列（酶切位點5’端加上適當數(shù)量的保護堿基）。5’端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。5’端標記放射性元素或非放射性物質（如生物素、地高辛等）。第四十頁，共五十三頁，2022年，8月28日

引物的內部穩(wěn)定性過去認為，引物3’端應牢牢結合在模板上才能有效地進行延伸，故3’端最好為G或C?，F(xiàn)在的觀點認為，引物的5’端應是相對穩(wěn)定結構，而3’端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結構，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。僅僅3’端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低穩(wěn)定性結構是難以有效引發(fā)引物延伸的。如果3’端為富含G、C的結構，只需3’端幾個堿基與模板互補結合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。第四十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物的保守性與特異性保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別特異性：避免非特異性擴增第四十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日擴增區(qū)域的二級結構模板DNA的某些區(qū)域具有高度復雜的二級結構，在選擇引物時，應使擴增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。擴增區(qū)域的自由能（△G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30℃Tmproduct=81.5+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))+0.41(%G+%C)-500/length第四十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物與PCR引物濃度：一般為引物濃度(uM)=nOD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2OVH2O(單位：L)退火溫度最適退火溫度（TaOpt）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。第四十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日引物設計軟件PrimerPremier5.0生物軟件網(wǎng)下載安裝后，用文本編輯器打開WIN.INI，將vspace=