化學(xué)發(fā)光免疫分析與其他方法對(duì)比

化學(xué)發(fā)光免疫分析

免疫學(xué)檢測(cè)發(fā)展簡(jiǎn)介

免疫學(xué)檢測(cè)主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。免疫分析經(jīng)歷了放射免疫檢驗(yàn)、熒光免疫檢驗(yàn)、酶標(biāo)免疫檢驗(yàn)等不同時(shí)期，化學(xué)發(fā)光免疫檢驗(yàn)是免疫分析發(fā)展的一個(gè)新階段，它環(huán)保、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)已得到人們的普遍認(rèn)識(shí)。

因此化學(xué)發(fā)光免疫分析是通往免疫檢驗(yàn)完美境界的必經(jīng)之路。

表1.1中國(guó)免疫診斷現(xiàn)狀

中國(guó)國(guó)際（歐美為主）放射免疫法（ＲＩＡ）．興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級(jí)以上醫(yī)院；．產(chǎn)品處于衰退期；．廠(chǎng)商試劑與儀器共同開(kāi)發(fā)，試劑基本系列化。．興起于20世紀(jì)60年代，現(xiàn)已基本退出臨床應(yīng)用；．產(chǎn)品生命周期已終結(jié)；．廠(chǎng)商試劑和儀器共同開(kāi)發(fā)，試劑基本系列化。酶聯(lián)免疫法（ＥＬＩＳＡ）．興起于20世紀(jì)80年代，現(xiàn)普遍使用于各級(jí)臨床機(jī)構(gòu)，為我國(guó)臨床免疫診斷的基本方法；．產(chǎn)品處于成熟期；．廠(chǎng)商試劑與儀器共同開(kāi)發(fā)，試劑尚未系列化。．興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍在臨床應(yīng)用；．產(chǎn)品處于衰退期；．廠(chǎng)商試劑與儀器共同開(kāi)發(fā)，試劑基本系列化。化學(xué)發(fā)光免疫法（ＣＬＩＡ）．導(dǎo)入于20世紀(jì)90年代，現(xiàn)個(gè)別較大醫(yī)院開(kāi)展個(gè)別項(xiàng)目；．產(chǎn)品處于導(dǎo)入期或成長(zhǎng)期；．無(wú)廠(chǎng)商開(kāi)發(fā)生產(chǎn)，完全依賴(lài)進(jìn)口．興起于20世紀(jì)80年代，現(xiàn)已被臨床普遍使用，成為臨床免疫診斷的支柱方法；．產(chǎn)品處于成熟期；．廠(chǎng)商試劑與儀器共同開(kāi)發(fā)，儀器自動(dòng)化程度高，試劑系列化狀態(tài).化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)原理化學(xué)發(fā)光免疫分析（ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA）是將化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測(cè)微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。化學(xué)發(fā)光是在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。其機(jī)制為某些化合物（發(fā)光劑或發(fā)光底物）可以利用一個(gè)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。免疫測(cè)定(immunoassay)是利用抗原體反應(yīng)來(lái)測(cè)定標(biāo)本中微量物質(zhì)的方法。1.使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。2.使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

3.洗滌后加入發(fā)光底物，酶促使發(fā)光底物發(fā)光，通過(guò)專(zhuān)用的儀器檢測(cè)光子的數(shù)量，從而反算出未知抗原或抗體的濃度。化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)原理在化學(xué)發(fā)光免疫分析，其基本原理同酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA），常采用雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、等反應(yīng)模式，

圖1.2雙抗體夾心法反應(yīng)原理示意圖

化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)原理歷史發(fā)展產(chǎn)品的對(duì)比：

1、化學(xué)發(fā)光與酶免的對(duì)比

2、化學(xué)發(fā)光與放免的對(duì)比

3、化學(xué)發(fā)光與時(shí)間分辯熒光檢測(cè)的對(duì)比

4、化學(xué)發(fā)光的突出優(yōu)點(diǎn)化學(xué)發(fā)光與酶免的對(duì)比酶免原理：1.使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。2.使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。3.洗滌后加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。

化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)的靈敏度與可測(cè)范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶免產(chǎn)品，兼具ELISA法簡(jiǎn)便的操作方法與較短的反應(yīng)時(shí)間。

化學(xué)發(fā)光與酶免的對(duì)比表：酶標(biāo)化學(xué)發(fā)光測(cè)量精度定性/半定量測(cè)量定量測(cè)量人體傷害底物有致癌性無(wú)有效期較長(zhǎng)長(zhǎng)干擾因素較多極少測(cè)試項(xiàng)目少多化學(xué)發(fā)光與放免的對(duì)比放免原理是使用具有放射性的I125作標(biāo)記物，然后用測(cè)量射線(xiàn)計(jì)數(shù)儀放射性（125I）。對(duì)環(huán)境的污染及對(duì)身體的危害，已經(jīng)為重視環(huán)保的國(guó)家逐步取消。（如整個(gè)歐洲僅尚存幾個(gè)放免試驗(yàn)室）125I的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短標(biāo)記物125I的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)有效期短，必須每次定標(biāo)，造成浪費(fèi)。

操作繁瑣，出報(bào)告時(shí)間長(zhǎng)?；瘜W(xué)發(fā)光與放免的對(duì)比表：放免化學(xué)發(fā)光測(cè)量精度較高高人體傷害放射性無(wú)有效期較長(zhǎng)長(zhǎng)干擾因素較多極少測(cè)試項(xiàng)目較多多化學(xué)發(fā)光與時(shí)間分辨的對(duì)比：

時(shí)間分辨免疫檢測(cè)原理和化學(xué)發(fā)光基本一樣，只是標(biāo)記物改為稀土元素，不用發(fā)光底物但需要外在的穩(wěn)定光源照射，光的波長(zhǎng)產(chǎn)生stoke位移，并有一個(gè)時(shí)間滯后以便于檢測(cè)波長(zhǎng)改變后的光子數(shù)量。

1、化學(xué)發(fā)光成本低于時(shí)間分辨熒光免疫分析。

2、化學(xué)發(fā)光比時(shí)間分辨熒光免疫試劑盒更穩(wěn)定

3、化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒對(duì)對(duì)測(cè)試環(huán)境條件要求低。

4、化學(xué)發(fā)光不需要外光源，儀器可靠性更高化學(xué)發(fā)光與時(shí)間分辯熒光的對(duì)比：化學(xué)發(fā)光時(shí)間分辯熒光標(biāo)記物酶-發(fā)光底物兩級(jí)放大稀土離子，如銪穩(wěn)定性穩(wěn)定性非常好影響被標(biāo)記物的生物活性與免疫活性靈敏度靈敏稍高于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系接近中性酸性，易引起蛋白質(zhì)變性包被技術(shù)不透明微量孔壁吸附,提高分析靈敏度,降低本底采用透明微量孔壁吸附，孔壁的透明度會(huì)引起,本底干擾技術(shù)性新技術(shù)，很成熟新技術(shù)，不成熟干擾因素干擾極小容易受內(nèi)外源稀土離子的干擾測(cè)試項(xiàng)目

項(xiàng)目齊全(見(jiàn)試劑報(bào)價(jià)單)缺少部分項(xiàng)目。如：貧血（葉酸，鐵蛋白，維生素B12）化學(xué)發(fā)光免疫分析的優(yōu)點(diǎn)：

1．靈敏度高：這是CLIA關(guān)鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達(dá)10-16mol/L（RIA為10-12mol/L）。又如化學(xué)發(fā)光底物（如AMPPD）可檢測(cè)出的堿性磷酸酶的濃度比顯色底物要靈敏5х105倍。2．寬的線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)范圍：發(fā)光強(qiáng)度在4～6個(gè)量級(jí)之間與測(cè)定物質(zhì)濃度間呈線(xiàn)性關(guān)系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（OD值）為2.0的范圍相比，優(yōu)勢(shì)明顯。雖然RIA也有較寬的線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)范圍，但放射性限制了其應(yīng)用。3．光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)：輝光型（glowtype）的CLIA產(chǎn)生的光信號(hào)持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至一天。簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作及測(cè)量?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析的優(yōu)點(diǎn)：

4．分析方法簡(jiǎn)便快速：絕大多數(shù)分析測(cè)定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步模式。

5．結(jié)果穩(wěn)定、誤差?。簶悠废抵苯幼约喊l(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來(lái)的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。6．安全性好及使用期長(zhǎng)：在上述優(yōu)點(diǎn)前提下，更免除了使用放射性物質(zhì)。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)CLIA的危害性。有效期可長(zhǎng)達(dá)1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰變，一般有效期只有一個(gè)月，而酶聯(lián)的底物貯存性差，都無(wú)法與化學(xué)發(fā)光相比，有效期長(zhǎng)可以提高勞動(dòng)效率，也利于推廣應(yīng)用。

總結(jié)綜合以上優(yōu)點(diǎn)，目前已有的各種免疫分析尚沒(méi)有出其右者，現(xiàn)在國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家在CLIA的研究和開(kāi)發(fā)方面進(jìn)展很快，已有全自動(dòng)的化學(xué)發(fā)光（閃光型和輝光型）與電化學(xué)發(fā)光免疫分析等系列產(chǎn)品。我國(guó)在化學(xué)發(fā)光免疫分析方面的研究還比較落后，這就是我國(guó)急需研究和發(fā)展CLIA的原因。

基本性能對(duì)照表【化學(xué)發(fā)光免疫分析種類(lèi)】

1.直接化學(xué)發(fā)光A吖啶酯發(fā)光原理：納米磁珠分離后的吖啶酯標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，在含H2O2的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿激發(fā)底物的作用下，快速發(fā)出可見(jiàn)光，通過(guò)光電倍增管進(jìn)行光子計(jì)數(shù)，相對(duì)光強(qiáng)度RLU與待測(cè)抗原濃度成函數(shù)關(guān)系。特點(diǎn)：發(fā)光過(guò)程在5秒內(nèi)完成，激發(fā)發(fā)光程序簡(jiǎn)單，測(cè)試速度快，但發(fā)光標(biāo)記物吖啶酯在緩沖液中不穩(wěn)定，易水解，影響試劑穩(wěn)定性。代表儀器：拜耳公司的ACS180。【化學(xué)發(fā)光免疫分析種類(lèi)】B異魯米諾發(fā)光原理：發(fā)光過(guò)程和原理與吖啶酯完全相同，但激發(fā)發(fā)光速度更快，在3秒內(nèi)完成整個(gè)過(guò)程，測(cè)試速度最快，而且克服了吖啶酯在緩沖液不穩(wěn)定、易水解的缺點(diǎn)。代表儀器：德國(guó)Byk–Sangtec公司的LIAISONC電化學(xué)發(fā)光原理：納米磁珠分離后的三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，在三丙胺的作用下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，發(fā)出可見(jiàn)光，通過(guò)光電倍增管進(jìn)行光子計(jì)數(shù)，相對(duì)光強(qiáng)度RLU與待測(cè)抗原濃度成函數(shù)關(guān)系。特點(diǎn)：激發(fā)發(fā)光過(guò)程復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，每一個(gè)發(fā)光過(guò)程約需25秒，測(cè)試速度慢。代表儀器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS1010和ELECSYS2010?！净瘜W(xué)發(fā)