【知識(shí)】病毒包裝相關(guān)知識(shí)匯總

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持【關(guān)鍵字】知識(shí)病毒包裝相知識(shí)匯總應(yīng)用領(lǐng)域隨著分子生物學(xué)的理論及技術(shù)方(特是重組DNA技術(shù)的速展可以在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建各種載體及分析目標(biāo)基因病入至分子水平研究誕了基因診斷、基因治療技術(shù)?；蛑委煆幕蚪嵌壤斫馐菍?duì)缺陷的基因進(jìn)行修復(fù)增補(bǔ)正常功能的基因置換的方法。從療角度理解是一種基導(dǎo)入遺傳物質(zhì)以改變患者細(xì)胞的基因表達(dá)從而達(dá)到治療或預(yù)防疾病的目標(biāo)的新措施。當(dāng)代基因治療研究的熱門(mén)方法是將外源DNA片導(dǎo)入靶細(xì)胞或組織，研究靶基因的上調(diào)或抑制情況。例如，有些異?；?癌因、病毒基因，通過(guò)反義核酸技術(shù)引入外源片段將其抑制基本有治療作用合成該基因?qū)塍w內(nèi)使其表達(dá)豐度提高。故選擇合適高效的基因?qū)虢橘|(zhì)系統(tǒng)尤為關(guān)鍵毒載體已成為當(dāng)前基因治療載體研究的熱點(diǎn)。病毒載體的優(yōu)勢(shì)：1、利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，感染效率高；2、病毒的宿主范圍廣，可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；3、病毒基因組的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子背景比較清楚，穩(wěn)定易于改造、易于制備；4、復(fù)雜的裝配過(guò)程由細(xì)胞完成；5、不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)；6、通過(guò)載體改造的方式形成了復(fù)制缺陷型結(jié)構(gòu)，安全性高；7、病毒包裝技術(shù)經(jīng)歷了多年的研究，已趨于成熟，可用于產(chǎn)業(yè)化大量生產(chǎn)慢病毒包裝技術(shù)背景：慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，慢病毒（Lentivirus）體是以（類(lèi)免疫缺陷1型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的病毒載體有感染廣泛可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞浮胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞且感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)，成為導(dǎo)入外源基因的有力工具。目前慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細(xì)胞系的基因過(guò)表達(dá)干等研究以及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。技術(shù)原理：慢病毒載體系統(tǒng)包含了包裝轉(zhuǎn)穩(wěn)整合所需要的遺傳信息且能提供慢病毒所有的轉(zhuǎn)錄并包裝到組的假病毒載體所需要的所有輔助白。第三代四質(zhì)粒慢病毒載體系統(tǒng)較于前代慢病毒載體全性大大提升包括如下成分基因轉(zhuǎn)移表載體；b.輔載體。利用表達(dá)載體和輔助載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝裝的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中離心取上清液后純化病毒以直接用于宿主細(xì)胞的感染的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。1文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持技術(shù)特點(diǎn)：1、直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用。2、可以通過(guò)簡(jiǎn)單方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。3、可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。4、無(wú)需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡(jiǎn)便。5、可以根據(jù)需要多種標(biāo)記。技術(shù)應(yīng)用：1、將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒/擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞；2、將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒干質(zhì)粒轉(zhuǎn)入動(dòng)物組織，以期獲得長(zhǎng)期表達(dá)；3、構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)/干擾細(xì)胞系，再用的方法導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)；4、基因治療；5、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；6、基因敲除；7、藥物研究：構(gòu)建表達(dá)受體蛋白的細(xì)胞系，研究藥物的作用；8、快速建立生產(chǎn)目的蛋白的細(xì)胞系，非常有前途的真核細(xì)胞表達(dá)方法。技術(shù)流程概述：1、基因合成及病毒載體構(gòu)建2、轉(zhuǎn)染及驗(yàn)證3、細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒包裝4、收獲病毒液及病毒純化5、病毒滴度檢測(cè)6、感染效果或評(píng)價(jià)慢病毒包裝常用質(zhì)粒圖譜：腺病毒包裝技術(shù)背景：腺病毒Adenovirus）是一種非整合型雙鏈DNA毒，在自然界中廣泛分布。雖然一些類(lèi)型的腺病毒會(huì)引起人胃腸道呼吸道或眼部上皮細(xì)胞的急性感染是用于基因治療研究的腺病毒是安全的，對(duì)人無(wú)致病、致畸、致癌的潛在危害。根據(jù)JournalofGeneMedicine的統(tǒng)計(jì)，截至2006年，在全球項(xiàng)基因治療臨床試驗(yàn)方案中，有305項(xiàng)26%)使用腺病毒載體，首次超過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒，居第一位。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道，所以它所介導(dǎo)的基因治療可以靜脈注射可以通過(guò)口服經(jīng)腸道吸收通過(guò)噴霧滴經(jīng)呼吸道吸收，使得基因治療方案易于推廣應(yīng)用。技術(shù)原理：腺病毒（）是一種無(wú)包膜的雙鏈線(xiàn)性DNA毒，基因組長(zhǎng)約36kb，衣殼呈規(guī)則的20面結(jié)構(gòu)。腺病毒外源基因裝載容量大，且能夠感染絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括分裂和不分裂的細(xì)胞了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞病適用于在難以轉(zhuǎn)染的2文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持細(xì)胞中進(jìn)行干、過(guò)表達(dá)特定基因和vivo驗(yàn)。常用重組腺病毒系統(tǒng)組成病骨架載攜帶腺病毒主要功能基因載（轉(zhuǎn)移外源基因表達(dá)盒到骨架載體上應(yīng)最為廣泛的是AdMax腺病毒載體系統(tǒng)骨質(zhì)粒和穿梭載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)中通過(guò)Cre/loxP實(shí)現(xiàn)載重組而產(chǎn)生重組腺病毒。通過(guò)裂解細(xì)胞收獲病毒粒子，病毒粒子經(jīng)過(guò)反復(fù)擴(kuò)增與純化可得到高滴度的腺病毒。技術(shù)特點(diǎn)1、幾可以感染所有類(lèi)型的細(xì)胞，包括分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；2、可獲得復(fù)制缺陷型E1和E3缺失）的腺病毒；3、病滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過(guò)濃縮后可以達(dá)到10PFU/mL；4、腺毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡(jiǎn)單；5、感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，生物安全性高。技應(yīng)1、應(yīng)于體內(nèi)接種疫苗攜免疫調(diào)節(jié)基因或腫瘤特異抗原已近的腺病毒載體轉(zhuǎn)入相應(yīng)腫瘤細(xì)胞以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，可制成具有抗腫瘤活性的瘤苗。2、應(yīng)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因轉(zhuǎn)位coIP，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，干細(xì)胞研究等科研實(shí)驗(yàn)。3、可以成較高難度的克隆構(gòu)括具有細(xì)胞毒性作用基因的腺病毒構(gòu)建在短時(shí)間內(nèi)完成從原始質(zhì)粒到病毒DNA的建工作。4、產(chǎn)滴度高，非常適于基因治療。技流1、構(gòu)建穿梭質(zhì)粒以含目的基因的質(zhì)粒為模板，分別在兩個(gè)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)目的基因，雙酶切后插入穿梭質(zhì)粒。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染將取骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293胞。3、將PacI消后的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染AD293細(xì)，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。4、將病毒粗提液感染293A細(xì)以擴(kuò)增病毒。5、收集病毒顆粒分裝，℃存。腺毒裝用粒譜腺關(guān)毒裝技背：腺相關(guān)病毒adeno-associatedvirus，AAV于微小病毒(，無(wú)包膜的單鏈線(xiàn)狀DNA病要助病常為腺病毒復(fù)制的基因組約4800bp，兩個(gè)ITR序列和兩個(gè)開(kāi)放閱讀框具有多種常見(jiàn)血清型100多病毒變種。其中AAV2是目前應(yīng)用最廣的腺相關(guān)病毒，對(duì)多數(shù)常見(jiàn)細(xì)胞均有較好效果。重組腺相關(guān)病毒載體rAAV)源非致病的野生型腺相關(guān)病毒于安全性好主細(xì)胞范圍廣(分裂和非分裂細(xì))免疫源性低在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)廣用于體3文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究腺關(guān)病毒載體成為世界上最常用的基因治療載體之一相病毒載體整合率遠(yuǎn)低于慢病毒載體可以以染色體外形式長(zhǎng)數(shù)月至數(shù))存在于非分裂細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)外源基因長(zhǎng)期表達(dá)。技原：常用腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)AAVHelper-Free，能產(chǎn)生AAV2血型病毒而無(wú)需輔助病毒。該系統(tǒng)包含個(gè)質(zhì)粒1個(gè)組表達(dá)質(zhì)粒和2個(gè)助質(zhì)粒。將目的基因克隆至重組pAAV載上；將AAV感必須的腺病毒基因E2A、E4及VA等）構(gòu)建至輔助質(zhì)粒pHepler上，將AAV復(fù)制基因rep和capsid結(jié)基因cap建至質(zhì)粒pAAV-RC上三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)腺病毒E1基因細(xì)胞，在細(xì)胞進(jìn)行病毒的包裝。通過(guò)裂解細(xì)胞，離心取得上清液后進(jìn)一步濃縮純化，收集病毒。技特：1、安全，不與任何疾病的發(fā)生，已經(jīng)用于臨床疾病治療；2感范圍廣可以用于神經(jīng)系統(tǒng)睛心肌肝臟肉和肺部定位注射或定向給藥；2、滴度高，顆粒小，擴(kuò)散能力；3、表達(dá)穩(wěn)定，可持續(xù)半年以上4、外源基因定向重組，免疫原低，極少發(fā)生非特異反應(yīng)和免疫抑制，適合于進(jìn)行基因治療研究。技流：1、病毒載體構(gòu)建2、腺相關(guān)病毒包裝3、腺相關(guān)病毒濃縮與純化4、病毒滴度檢測(cè)腺關(guān)毒裝用粒譜附：12種同清AAV對(duì)組器細(xì)的和血清型AAV1AAV2AAV3AAV4AAV5AAV6AAV7AAV8AAV9DJDJ/8Rh10

組織親和性肌肉，心臟，骨骼?。òㄐ募。窠?jīng)組織中樞神經(jīng)，肌肉，肝臟，腦組織，眼，肌肉，肝臟，肺，眼中樞神經(jīng)，肌肉，眼，腦肺，眼，中樞神經(jīng)，關(guān)節(jié)滑膜，胰腺肺，心臟肌肉，肝臟肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉心臟，肌肉，肺（肺泡），肝臟，中樞神經(jīng)肝臟，視網(wǎng)膜，肺，腎臟肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉肺心，肌肉，中樞神經(jīng)，肝臟附：見(jiàn)病毒體生學(xué)性較隨著基因治療的廣泛應(yīng)用學(xué)們陸續(xù)開(kāi)發(fā)出多種病毒載體于源基因?qū)氚屑?xì)胞或組織。4文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持這些病毒載體各有優(yōu)點(diǎn)中病毒包裝簡(jiǎn)單期短穩(wěn)定表達(dá)病滴度高、感染及表達(dá)蛋白的能力強(qiáng)；腺相關(guān)病毒安全性高達(dá)定在實(shí)驗(yàn)中，均需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行實(shí)際選擇。特將這三種病毒的生物學(xué)特性整理如下：慢毒Lentivirus腺相?。ˋAV）

腺毒）病類(lèi)包容包顆直包基組表起時(shí)表持時(shí)宿基組合式親性免原

RNA8kb有90-100nm有dsRNA48-72h>2months隨機(jī)高頻整合感染譜廣低

ssDNA<5kb無(wú)20-30nm無(wú)ssDNA72-96h>6months定向低頻整合或非整合感染譜廣低

dsDNA8kb無(wú)60-90nm無(wú)dsDNA24-48h~1month非整合感染譜廣高隨機(jī)整合存在引發(fā)主缺

包裝容量小

免疫原性低，無(wú)致病性腫瘤的可能性在大部分組織中獲

大部分組織都可以獲得主優(yōu)

免疫原性強(qiáng)得穩(wěn)定表達(dá)附：何據(jù)實(shí)目選合的毒體

較高感染效率項(xiàng)目慢毒（LV

腺病毒（）

腺相關(guān)病毒（AAV）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體外實(shí)驗(yàn)

靜脈注射定點(diǎn)注射細(xì)胞回輸過(guò)表達(dá)干擾

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++++++---5文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支.

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MicroRNACRISPR/Cas9CAR-T自噬光遺傳

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----+++附：毒裝常問(wèn)與答—綜問(wèn)、病包的鍵什？病毒包裝的幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)就是細(xì)胞因素系統(tǒng)盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng)構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制（24小時(shí)細(xì)胞及熒光狀態(tài)判斷的因?qū)Σ《景绊?因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會(huì)影響到是否能包裝成功、病載種應(yīng)何擇答：穩(wěn)定長(zhǎng)時(shí)表達(dá)研究選擇慢病毒，比如穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選；病毒使用量大選擇腺病毒，比如老鼠實(shí)驗(yàn)；基因治療選擇腺相關(guān)病毒。操作難度上慢病毒與腺病毒都差不是指重組病毒的制備和純化角度來(lái)說(shuō)的，AAV的制備就更復(fù)雜更難一些。從載體毒性而言慢病毒毒性較但它相對(duì)較少引起受體的免疫原性腺毒則有較大的免疫原性腺相關(guān)病毒載是比較理想的基因治療載體疫原性較低而且對(duì)受體傷害較少。從插入目的基因角度考慮，慢病毒最大插入基因長(zhǎng)度是5k腺病毒最大插入基因長(zhǎng)度是，相關(guān)病毒最大插入長(zhǎng)是體參考附2：常見(jiàn)的病毒載體及生物學(xué)特性比較）至于具體是選擇腺病毒好還是慢病毒或別的病毒載體好要還看你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康钠浯尾攀强茨哪欠N病毒載體容易做開(kāi)瑞的研究人員有豐富的病毒研究和使用經(jīng)驗(yàn)詢(xún)我們的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)，您可以獲取更多幫助。、病載對(duì)的因長(zhǎng)是有求AAV的總包裝容量是kb體（兩個(gè)ITR共290bp（750bp）（約150bp1200bp如用AAV裝載體基因長(zhǎng)度要求不超過(guò)3.5kb。相對(duì)應(yīng)慢病毒目的基因長(zhǎng)度不超過(guò)5kb腺病毒載體目的基因長(zhǎng)度要求不超過(guò)8kb。、如選合的動(dòng)用體動(dòng)實(shí)？部分質(zhì)粒載體的啟動(dòng)子所含GC量比較高，所以進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)表觀(guān)遺傳學(xué)信號(hào)通路進(jìn)甲基化飾或者在染色體整合位點(diǎn)進(jìn)行去乙?；揎棌亩种苹虻谋磉_(dá)。體外細(xì)胞的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)偶爾發(fā)生類(lèi)似修飾，但比較罕見(jiàn)。所以，針對(duì)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尤其是利用病毒載體制備轉(zhuǎn)基因或者基因敲除、RNA擾小鼠等，需要選擇恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子才能表達(dá)外源插入片段們擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)們的啟動(dòng)子庫(kù)可以幫助研究人員選擇合適的啟動(dòng)子用于特定的實(shí)驗(yàn)。、什時(shí)需使誘表系？誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)無(wú)論是對(duì)于體外基因功能研究還是體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)非常有用的一套系6文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持統(tǒng)，當(dāng)研究遇到以下情況時(shí)，建議使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：a、所達(dá)基因或者外源片段具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、引起細(xì)胞毒性等特性；b、需在特定時(shí)間開(kāi)啟或關(guān)閉外源片段的表達(dá)。、成構(gòu)誘表系的鍵什？一個(gè)成功的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，需要達(dá)到以下效果：a、對(duì)于誘導(dǎo)激活系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，需在未激活前保持很低的表達(dá)水平，而激活后，能迅速地高水平并且穩(wěn)定表達(dá)。b、對(duì)于誘導(dǎo)關(guān)閉系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，需在關(guān)閉前可以維持正常的表達(dá)水平，而添加誘導(dǎo)關(guān)閉物后，能迅速?gòu)氐椎仃P(guān)閉基因的表達(dá)。而影響誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功的因素主要有以下幾點(diǎn)：a、誘導(dǎo)表達(dá)載體自身調(diào)控元件包括啟動(dòng)子的強(qiáng)弱、啟動(dòng)子對(duì)誘導(dǎo)物的響應(yīng)效果、載體啟動(dòng)子外其它調(diào)控元件對(duì)插入片段表達(dá)的影響案包括使用組合誘導(dǎo)物以達(dá)到更佳效果，改造其它調(diào)控元件以減少泄露表達(dá)。b、穩(wěn)定整合位點(diǎn)：由于構(gòu)建誘表達(dá)系統(tǒng)必須在穩(wěn)定細(xì)胞株中實(shí)現(xiàn)，所以，穩(wěn)定整合位點(diǎn)附近的轉(zhuǎn)錄活性對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)影響很大錄活性過(guò)低導(dǎo)致誘導(dǎo)激活效果不佳轉(zhuǎn)錄活性過(guò)高致導(dǎo)激活前表水平過(guò)高或者誘導(dǎo)關(guān)閉后仍然有殘留表達(dá)此需要構(gòu)建多株穩(wěn)定細(xì)胞株，并進(jìn)行比較，挑取誘導(dǎo)前后均符合預(yù)期的一株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3)穩(wěn)整合后拷貝數(shù)數(shù)高也會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)激活前表達(dá)水平過(guò)高或者誘導(dǎo)關(guān)閉后仍然有殘留表達(dá)。所以建議使用逆轉(zhuǎn)(包括慢病載體獲得單拷貝細(xì)胞穩(wěn)定株。、如使病液感靶胞不同的重組病毒載體不同的細(xì)以動(dòng)物體內(nèi)組織細(xì)胞侵染其具體的操作步驟都有所不同。所以建議研究人員依據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)選擇不同的操作步驟。、病可高感任靶胞？理論上現(xiàn)有的病毒載體可以在何條件下高效感染任何靶細(xì)胞依據(jù)是病毒載體高效感染細(xì)胞主要受三個(gè)參數(shù)影響：細(xì)胞特性分裂和非分裂細(xì)胞體內(nèi)所處環(huán)境是否存在血腦屏障等阻礙有的病毒載體，綜合起來(lái)可以侵染分裂細(xì)胞，也可以侵染非分裂細(xì)胞，而且還可以突破血腦屏障高效侵染腦神經(jīng)細(xì)胞。細(xì)胞種類(lèi)不同組織細(xì)胞雖不同載體對(duì)不同組織細(xì)胞的侵染有傾向性通過(guò)改造病毒載體決定病毒表面糖蛋白的序列使針對(duì)同一類(lèi)病毒可以獲得最高達(dá)數(shù)百種不同侵染特性的載體系列，從而可以滿(mǎn)足不同細(xì)胞類(lèi)型的侵染需求。病毒載體的滴度。除同類(lèi)病其滴度會(huì)不同外，病毒載體的滴度還受包裝片段的特性影響括入片段的毒性和小源段的毒性可以通過(guò)使用誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)或者改造病毒包裝細(xì)胞系來(lái)減輕毒性影響入段的大小的影響可以通過(guò)選擇對(duì)外源片段具不同容納能力的病毒載體來(lái)避免。金開(kāi)瑞擁有龐大的病毒載體庫(kù)以廣程度地覆蓋各種組織細(xì)胞時(shí)以覆蓋不同特性的細(xì)胞有種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和經(jīng)過(guò)改造的病毒包裝細(xì)胞系可以包裝具有細(xì)胞毒性的外源插入片段。7文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持、如才用組毒體細(xì)上出意結(jié)？病毒載體在細(xì)胞試驗(yàn)中要想取得滿(mǎn)意的結(jié)果，主要在以下幾個(gè)方面：①病毒載體在不同的細(xì)胞由于細(xì)胞表面受體的差異而不同轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不同選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高的細(xì)胞，可用參考文獻(xiàn)報(bào)道和轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)告基因進(jìn)行篩選。②良好的細(xì)胞狀態(tài)。③最好在細(xì)胞狀態(tài)最佳時(shí)感染病毒別是不要在消化細(xì)胞后不久就感染為時(shí)細(xì)胞膜上的病毒受體往往受到了暫時(shí)的破壞，應(yīng)該培養(yǎng)過(guò)夜后再感染病毒，效果較好。④適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)MOI（病毒基因組細(xì)胞的比般可用上下做倍比稀釋。⑤適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)體積，如24孔板用200ul孔板0.5ml。⑥轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間為，25分晃動(dòng)培養(yǎng)板混勻一次導(dǎo)時(shí)，最好換用無(wú)血清培養(yǎng)基，因?yàn)檠鍖?duì)病毒的感染有些許不利影響）⑦可加合適輔助藥物刺激，增強(qiáng)表達(dá)。⑧適當(dāng)表達(dá)檢測(cè)時(shí)間是泌白可每連續(xù)取培養(yǎng)上清檢測(cè)常白表達(dá)量在幾百納克至幾微/ml水。10、何能病載在物內(nèi)出意的果病毒載體在動(dòng)物試驗(yàn)中要想取得滿(mǎn)意的結(jié)果，主要注意以下幾個(gè)方面：①選擇適當(dāng)?shù)难逍停豪绮煌腁AV血清型在動(dòng)物體內(nèi)同一組織有不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，如AAV1在肌肉組織中AAV5在組織中有很高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。②選擇適當(dāng)?shù)陌衅鞴僖磺逶诓煌慕M織具有不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率量擇轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高的靶器官。③轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：盡量選擇局部直接多點(diǎn)注射靶器官。④轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒量：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，所加病毒量太多表達(dá)量反而會(huì)降低。⑤檢測(cè)時(shí)間據(jù)驗(yàn)不同基因表達(dá)高峰時(shí)間是不同的般在2周檢測(cè)到基因表達(dá)，如無(wú)抗體產(chǎn)生的影響，基因的表達(dá)可持續(xù)表達(dá)半年以上的時(shí)間。11、于內(nèi)驗(yàn)重病，否求化？是的病毒純化很有必要為胞裂解液包含有缺損顆粒量的病毒外殼和penton蛋白（細(xì)胞毒素養(yǎng)基、血清以及細(xì)胞碎片。這些雜質(zhì)如果被注入動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)另純的作用還包括可以將病毒濃縮至一定濃度便于注射病懸浮于適于體內(nèi)注射的緩沖液中等。12、毒以縮稀嗎方如？可以濃縮對(duì)一般實(shí)驗(yàn)室用戶(hù)可以采用高速離心辦法濃縮前市面上的病毒濃縮純化辦法很多，有不少商業(yè)化產(chǎn)品。不同的病毒純化辦法不同。腺病毒載體可以用300K以下的濃縮離心管（PALL

公司產(chǎn)品）進(jìn)行濃縮。一般來(lái)說(shuō)濃縮后的滴度以不超過(guò)為，過(guò)濃可能致病毒聚集而產(chǎn)生沉淀?？梢韵♂屧趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中稀釋病產(chǎn)品的等滲溶液沒(méi)有其他特殊要求規(guī)動(dòng)物試驗(yàn)用等滲溶液即可，如PBS、理水等。稀釋后的樣品盡量一次用完。13、毒定濃么病毒一般可以收兩次在和72各收次你想麻煩濃縮病毒的話(huà)，8文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持也可以不濃縮將集的病上清作為要感染的細(xì)胞的培養(yǎng)基可能效果會(huì)不太好。并且一般收病毒時(shí)培基的營(yíng)已經(jīng)損耗了很多樣直接培養(yǎng)感染細(xì)胞會(huì)損害細(xì)胞所以建議還是進(jìn)行濃縮后再感染。14、VP，IFU

的別哪個(gè)更地映使的活的毒量VP：病毒顆粒viralparticle“活”（有感染性）和“死”（無(wú)感染性）的腺病毒顆粒的總量體實(shí)驗(yàn)中代了進(jìn)入肌體可能引起宿主針對(duì)腺病毒的免疫反應(yīng)的腺病毒顆?？偭俊y(cè)定方法是O法，只有經(jīng)過(guò)純化的腺病毒才能通過(guò)此方法測(cè)定VP/ml值。PFU：空斑形成單位（plaqueformationunit有感染性的“活”的腺病毒的總量即病毒得活性單位測(cè)定法是將腺病毒樣品經(jīng)過(guò)一系列梯度稀釋后染細(xì)胞并培養(yǎng)，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞病變空斑數(shù)得到腺病毒樣品中值。IU：感染單位（infectiousunitPFU一，是另一種腺病毒活性單位。測(cè)定方法是法VP/PFU或VP/IU的值判斷腺毒純品中活病毒所占比例的重要依據(jù)。如果該病毒產(chǎn)品要用于人體實(shí)驗(yàn)中生物制品質(zhì)量要求比值應(yīng)該在33以下于通實(shí)驗(yàn)研究，該比值要求可以適當(dāng)放寬。15、染胞佳MOI的定MOI（MultiplicityofInfection感染復(fù)數(shù)）是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的量以及目的蛋白的表達(dá)量越高。對(duì)于分裂活躍的細(xì)胞，比如HeLa、293胞，MOI=1時(shí)80%上的細(xì)胞均表達(dá)目的基因。而對(duì)于非分裂細(xì)胞，比如原代細(xì)胞，感染效率較低。我們建議通過(guò)比較不M（如0、100等適合的MOI行實(shí)（可以考慮選用攜帶報(bào)告基因的病毒，比如Lenti-EGFP16、組毒品何輸保？病毒產(chǎn)品一般采取干冰運(yùn)輸。避免重組病毒反復(fù)凍融請(qǐng)情裝后-80保存建不要-℃長(zhǎng)期保存在我們提供的保存液中病毒產(chǎn)品℃保存期為半年建議保存?zhèn)€以上的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，重新測(cè)一次滴度。病毒產(chǎn)品解凍后最好保持在冰浴中，并盡快使用。如果解凍后的病毒一時(shí)用不完度夠高時(shí)可保存周最好盡快用完據(jù)們的經(jīng)驗(yàn)℃放置1周滴度會(huì)有4~5倍的下。17、提這病產(chǎn)的全如？使用病毒載體的危險(xiǎn)性主要有以下幾個(gè)考慮因素：a、是否能重組產(chǎn)生致病性病毒b、是否具備復(fù)制能力；c、是否能整合，并導(dǎo)致癌基因活或者抑癌基因失活；d、免疫原性。金開(kāi)瑞所使用的病毒載體全部經(jīng)過(guò)改造去除了致病性元件和復(fù)制功能區(qū)因此重組產(chǎn)生功能性病毒的概率極低一分病(腺病毒和腺相關(guān)病毒載體)其合幾率低因9文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持安全性高。同時(shí)，針對(duì)部分具備整合能力的病毒載(慢病毒載體，還去除了其3’LTR內(nèi)的激活元件，排除了其激活下游基因的能力此，這些病毒載體用于體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)使用者而言都具有極高的安全性。有的病毒載體如相關(guān)病毒載體，即使用于人體，也被認(rèn)為是安全性非常高的一類(lèi)基因治療載體管如此們建議使用病毒載體進(jìn)行細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要遵循標(biāo)準(zhǔn)廢棄病毒載體操作流程。18、何證毒裝驗(yàn)安？病毒載體已經(jīng)被全世界許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用有現(xiàn)過(guò)任何意外仍具有潛在的產(chǎn)生復(fù)制型病毒（RCL）和致癌的風(fēng)險(xiǎn)操作者在實(shí)驗(yàn)中仍需要保持高度警惕！所有操作均應(yīng)盡量在BSL2級(jí)物安全柜中進(jìn)行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接觸口、眼、鼻、耳、傷口等身體開(kāi)放性區(qū)域，避免產(chǎn)生氣溶膠頭一定要選擇帶有濾芯的。必須高度注意被污染的尖銳物品，包括針頭、注射器、載玻片、移液管、毛細(xì)玻璃吸管和解剖刀每實(shí)驗(yàn)后即清理所有接觸過(guò)病毒的器具應(yīng)高壓消毒再進(jìn)行下一步處理。顯微鏡臺(tái)、生物安全柜臺(tái)面等使用后，70%醇擦拭。意外灑落的含病毒的液體，用衛(wèi)生紙吸干后，用0.6%氯酸鈉溶液浸泡被污染處1h裝盛病毒載體的實(shí)驗(yàn)用品，要單獨(dú)放置，標(biāo)示清楚標(biāo)注“危險(xiǎn)品”字樣盡使用培養(yǎng)瓶，不要使用培養(yǎng)板來(lái)感染病毒，以防意外灑落。對(duì)共用實(shí)驗(yàn)室的人員進(jìn)行病毒安全培訓(xùn)或提示。—關(guān)慢毒、慢毒體特及用圍慢病毒載體是有包膜的RNA病以感染分裂和非分裂細(xì)而逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染有絲分裂活性的細(xì)胞，在感染宿主細(xì)胞后不能自我復(fù)制。以水泡口炎病毒（VesicularStomatitisVirus）膜G蛋白VSV-G替換生型包膜蛋白，使重組慢病毒感染范圍覆蓋了各種傳代和原代的腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，以及干細(xì)胞T細(xì)胞等。、金瑞物重慢毒用種統(tǒng)金開(kāi)瑞生物使用第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，包括輔助質(zhì)粒1個(gè)用插入目的基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，三個(gè)毒粒組裝必須的基因Pol，Gag，Rev）被分開(kāi)裝載于不同的質(zhì)粒上，包裝過(guò)程中必須4質(zhì)共轉(zhuǎn)才能成功出毒，最大限度降低了重組概率。同時(shí)三代轉(zhuǎn)移質(zhì)粒5’和3’LTR都刪缺失了野生型的U3成為不能自我復(fù)制的自滅活SIN）載體。、慢毒體物全如？重組慢病毒載體已經(jīng)刪除了所有野生型毒性基因，感染細(xì)胞后只表達(dá)裝載的目的基因，不表達(dá)任何野生型病毒的基因自活序列修飾使其不能復(fù)制，包膜糖蛋白做了pseudotyped替換為VSV-G。此三代包裝系統(tǒng)的改造保證了慢病毒載體的生物安全性，目前未有致瘤報(bào)道。、影慢毒量因有些包裝過(guò)程中，慢病毒的產(chǎn)量隨著插入片段的增大而呈指數(shù)下降，一般當(dāng)目的基因＞2k時(shí)即會(huì)可見(jiàn)顯著的出毒效率降低，當(dāng)接近4k時(shí)其出毒量會(huì)低至可以使用的下限、或幾乎不出毒。插入序列的GC含量＞70%時(shí)產(chǎn)會(huì)受到影響一些對(duì)包裝細(xì)胞有毒性的基因也會(huì)導(dǎo)文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡迎下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持致難以產(chǎn)毒。5.、病載可容多的入因整個(gè)慢病毒基因組在5’’LTR之間的最大容納能力約由于轉(zhuǎn)移載體中各種表達(dá)原件的存在，載體的實(shí)際裝載極限在4k左。一般的基因已無(wú)法作產(chǎn)量保證。、該何擇移體根據(jù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用需求，主要從啟動(dòng)子、熒/抗性標(biāo)簽等角度選擇載體所攜帶的原件。過(guò)表達(dá)目的序包括編碼基因碼RNA通常選擇CMV啟子些情況可能使用EF1a啟動(dòng)子；進(jìn)行shRNA干時(shí)通常選擇U6啟子。后續(xù)進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選時(shí)，需攜帶如的抗性篩選基因。攜帶、mCherry等熒光蛋白便于直觀(guān)監(jiān)測(cè)病毒感染效率，但在后續(xù)的免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)中，可能會(huì)由于波長(zhǎng)范圍干擾而帶來(lái)不便，例如GFP同F(xiàn)ITC互相干擾。另外當(dāng)目的基因較大時(shí)，攜帶不必要的熒光或篩選元件會(huì)進(jìn)一步降低出毒效率。、慢毒染多時(shí)可目基表？通常慢病毒介導(dǎo)的目的基因表達(dá)通常在72h左右到高峰數(shù)續(xù)檢測(cè)可在此階段進(jìn)行對(duì)于代謝快速的細(xì)胞在24h可看到熒光蛋白等較高表達(dá)的產(chǎn)物謝慢的細(xì)胞可能需要72-96h。、我前過(guò)病感造細(xì)，是達(dá)理，們有有的決法答慢毒載體介導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)的因素主要是病毒的感染能力和特定的啟動(dòng)子在該細(xì)胞中的強(qiáng)度VSV-G介導(dǎo)慢病毒載體對(duì)造血系統(tǒng)的細(xì)胞的感染能力并不合適，除了常規(guī)用的VSV-G外們司還擁有其它8病毒包膜蛋白庫(kù)我們會(huì)根據(jù)客戶(hù)的需要選擇特定的包膜蛋白是用特定的啟動(dòng)子使目的基因能在特定的細(xì)胞中得以高表達(dá)。、你提的病的度如測(cè)的這測(cè)方如何我到毒需自測(cè)滴嗎我們是在293T細(xì)株中對(duì)純化慢病毒進(jìn)行滴度測(cè)定的。常用有4種法進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定，分別是：①通過(guò)ELISA對(duì)毒顆粒中的p24白進(jìn)行檢測(cè)；②通過(guò)定量對(duì)毒顆粒的RNA行檢查；③通過(guò)定量對(duì)合到基因組DNA中病毒序列進(jìn)行檢測(cè)；④通過(guò)FACS對(duì)熒光蛋白的表達(dá)平進(jìn)行檢測(cè)。我們用基因組DNA定的法和熒光法進(jìn)行慢病毒滴度的檢測(cè)種方法并不能區(qū)分病毒顆粒是否有活性此定所得的滴度往往比后兩種方法高一至兩個(gè)數(shù)量級(jí)兩種方法確定的是有效的病毒滴度此更有意義于并非所有的病毒載體中都含有熒光蛋白此熒蛋白的表達(dá)有時(shí)還受啟動(dòng)子及表達(dá)的目的基因影響此過(guò)整合到基因組中的病毒序列進(jìn)行檢測(cè)是最佳方法?！P(guān)腺毒、腺毒體目基的度否要？有要求。對(duì)E1和E3雙缺的腺病毒載體，比如AdMax的KitC、KitD等其總包裝的外源片斷要求小于8。對(duì)于只有E1失或E3缺失的載體，比如KitA、KitB等外源片斷要求小于5。注意，源片斷指包括啟動(dòng)子、外源基因和polyA等在的整個(gè)文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡迎下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持插入片斷。、我試需多總的病載？腺病毒介導(dǎo)外源基因的基因治療研究一般分為體外培養(yǎng)細(xì)胞試驗(yàn)(體試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)體試)兩部分不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需要的病毒量也不盡相同據(jù)驗(yàn)完成一個(gè)完整的腫瘤治療實(shí)驗(yàn)需要腺病毒的病毒量總量約為3×10VP左右、如提腺毒活？提高腺病毒的活性鍵應(yīng)該是在病毒包裝過(guò)程和擴(kuò)增過(guò)程化程只是去掉有缺陷的病毒和細(xì)胞碎片等容易引起機(jī)體免疫反應(yīng)的過(guò)程果擴(kuò)增的病毒滴度高么純化后就會(huì)更高的?？说揭企w基中’’（未譯的外堿會(huì)響白達(dá)？UTR盡能短一些，特別是在5’要避免在里形二級(jí)結(jié)構(gòu)。在起始密碼子前面可以加一小段（）堿基序列可以增強(qiáng)目的基因的表達(dá)，比如Kozak序(GCCGCCACCATG)。、如判腺毒體否高感某細(xì)？參照文獻(xiàn)報(bào)道是最簡(jiǎn)單的辦法，也可以用帶報(bào)告基因的腺病毒先行預(yù)實(shí)驗(yàn)。Ad5能效感染絕大多數(shù)人類(lèi)、小鼠等的體細(xì)胞（包括分裂和非分裂細(xì)胞如肝、肌肉、神經(jīng)組織等。但對(duì)血液系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞，比如乳腺癌、白血病細(xì)胞等，感染效率較低。、腺毒體體實(shí)（vitro中注哪問(wèn)？1）由于細(xì)胞表面受體的差異，病毒載體在不同的細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不同?？筛鶕?jù)文獻(xiàn)報(bào)道或用帶報(bào)告基因的腺病毒載體判斷病毒用量。2）在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)感病毒效果較好。避免在消化細(xì)胞后立刻感染病毒，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞膜上的病毒受體往往受到了暫時(shí)的破壞。培養(yǎng)過(guò)夜后再感染病毒，效果較好。3選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)（毒感染單位/細(xì)胞數(shù)在MOI為0.1~1000范內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)10倍比釋。4）感染病毒時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液的體盡量小一些，以完全覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。如24孔板用200ul，6孔板1ml。5）感染時(shí)間為90分，每15分鐘輕晃動(dòng)培養(yǎng)液一次，以混勻。6）選擇適當(dāng)表達(dá)檢測(cè)時(shí)間，一感染病毒24h后就能檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，48小時(shí)表達(dá)達(dá)到較高水平。、用體試的病，否求化是的，病毒純化是很必要的。因?yàn)榧?xì)胞裂解液包含有缺損顆粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋（細(xì)胞毒素基、血清以及細(xì)胞碎片。這些雜質(zhì)如果被注入動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)的作用還包括可以將病毒濃縮至一定濃度便于注射、使病毒懸浮于適于體內(nèi)注射的緩沖液中等。如果的驗(yàn)需將組病注入物內(nèi)如果貴司供純產(chǎn)比濃需如稀病產(chǎn)，特要嗎在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中稀釋病毒產(chǎn)品的等滲溶液沒(méi)有其他特殊要求的動(dòng)物試驗(yàn)用等滲溶液即可，如PBS、生理鹽水等。稀后的樣品盡量一次用完，在沒(méi)有保護(hù)劑的情況下，腺病毒文檔來(lái)源為從網(wǎng)絡(luò)收集整.版可編輯歡迎下載支.

文檔來(lái)源為從絡(luò)收集整.版可編輯歡下載支持在2～8℃存時(shí)間越短越好。、小體注腺毒一小肌大多量體表達(dá)間表高如？大部分文獻(xiàn)顯示，腺病毒用量范圍在10

IU/只鼠。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，小鼠注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表達(dá)達(dá)到高峰一周后逐漸下降，持續(xù)表達(dá)時(shí)間在兩周左右。10、病載對(duì)鼠半死量LD50大是少根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，靜脈注射小鼠（昆明鼠死劑量大約為1×10v.p./只；裸鼠和SCID鼠能更敏感一些注式的LD50測(cè)到v.p./只藥發(fā)現(xiàn)小鼠死亡。11、么RCA，樣避？在擴(kuò)增或制備復(fù)制缺陷型腺病毒時(shí)會(huì)產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒（r