石蠟切片技術(shù)

生物制片技術(shù)

——石蠟切片和H-E染色【目的要求】通過制作動物石蠟切片和蘇木精-伊紅染色，了解石蠟切片制作和染色的基本原理和一般方法。【基本原理】——生物制片涂片法/滴片法壓片法裝片法/撕片法磨片法徒手切片法切片法石蠟冰凍火棉膠切片法概述先用某些特殊物質(zhì)滲入組織塊的內(nèi)部起支持作用，并將整個組織塊包住，再用精密的切片機(jī)制作切片，這種方法稱為包埋法。常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠、水和塑料等。根據(jù)包埋劑的不同，分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長處，但是使用得最多的還是石蠟切片技術(shù)。優(yōu)點：石蠟?zāi)芮谐鰳O薄的蠟片（2～10μm）；切片時能連成蠟帶，便于制作連續(xù)切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長期保存。缺點：制作過程較長，步驟很多，一步不慎往往導(dǎo)致前功盡棄；處理會引起組織塊或多或少地收縮；切片時受濕度影響比較大?！緦嶒炗闷贰?、器材：手術(shù)器械、雙面刀片、青霉素玻璃小瓶、烘箱、酒精燈、塑料面盆、單面刀片、蠟鏟、臺木、切片機(jī)、切片刀、毛筆、蠟帶盤、水浴鍋、染色缸、載玻片、顯微鏡等。2、試劑的配制：固定液、酒精、二甲苯、石蠟、蛋清、甘油、蘇木色精、氨水、鹽酸、伊紅、中性樹膠。【基本步驟】1、取材2、固定3、漂洗4、脫水5、透明6、透蠟7、包埋8、修塊9、切片10、貼片11、復(fù)水12、染色13、脫水14、透明15、封藏1.取材材料新鮮，操作迅速。刀要銳利，避免擠壓細(xì)胞。材料應(yīng)小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一般厚度2-5mm，長寬5-10mm。2.固定用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織和細(xì)胞，并將結(jié)構(gòu)成分轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì)，防止某些結(jié)構(gòu)的溶化和消失。使組織適當(dāng)硬化以便于隨后的處理。改變細(xì)胞內(nèi)部的折射系數(shù)并使某些部分易于染色。固定劑固定劑的作用對象主要是蛋白質(zhì)。良好的固定劑必須具備的特征：穿透速度快；不使組織膨脹或收縮以保持原形；硬化組織的程度適中；增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光度；增加媒染和染色能力；具有保存劑作用。簡單固定劑和混合固定劑簡單固定劑：乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸?；旌瞎潭▌〣ouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）固定劑的種類甚多，必須依據(jù)各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。固定時注意事項足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更新固定劑。一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者，要在使用前才混合。組織塊修整適度（后固定）3.漂洗目的：洗去滲入組織中的固定液，終止固定。以免影響對組織內(nèi)結(jié)構(gòu)的觀察、分析和研究。原則和方法：一般情況下是置水龍頭下以自來水流水沖洗。1）各種以水配制的固定液如甲醛，都必須用流水沖洗，大塊組織24小時，小塊組織2—10小時。2）多聚甲醛固定用于免疫組織化學(xué)等特殊染色時，應(yīng)將組織投入PB緩沖液中，每60分鐘更新洗滌液一次，累計6小時。3）固定液為酒精時，一般不需用水沖洗，可直接進(jìn)行脫水的程序。

4）經(jīng)含有苦味酸的固定液固定的組織塊，應(yīng)充分沖洗。水溶性固定液固定的組織塊一般須沖洗12小時，再進(jìn)入70%的酒精溶液洗滌；酒精溶性固定液固定的組織塊直接進(jìn)入70%的酒精溶液洗滌，可以脫掉苦味酸的黃色，但最好從50%酒精開始洗滌。5）用鋨酸或含有鋨酸的固定液固定的組織，必須用流水徹底沖洗干凈。6）沖洗好的組織可存放在75%酒精內(nèi)。脫水劑能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經(jīng)過透明，才能透蠟包埋；兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易于得到。4.脫水梯度酒精脫水目的避免劇烈的擴(kuò)散引起的組織強(qiáng)烈收縮。（15%）-30%-50%-70%-80%-95%-95%-100%-100%脫水時間依據(jù)組織的類型和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到1h。如果中間須停頓，應(yīng)使材料停留在70％乙醇中。因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時間不能過長。另外，脫水必須在有蓋瓶中進(jìn)行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可加入等量的甘油。5.透明組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經(jīng)過透明。透明劑既可與脫水劑相混合又能和石蠟相混合可置換組織內(nèi)的脫水劑，為下一步的浸蠟起到橋梁作用。使組織呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，有利于光線的透過。透明劑較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用較快，透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時若脫水不凈，就會引起不良后果。二甲苯:酒精（1:1）—二甲苯—二甲苯透明時間應(yīng)由組織大小而定，—般各級停留時間在30min至2h，總時間以不超過3h為宜。使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中水分進(jìn)入；更換透明劑，動作要迅速；材料經(jīng)過透明，會顯示出前一步脫水的效果，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點較低，透明較慢，但不會使組織變脆。苯的用法同于二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適于大塊組織的透明。6.透蠟透蠟：指將材料中的透明劑逐步清除，以至完全由石蠟充分滲透。包埋用的石蠟熔點在50～60℃之間，應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度、切片的厚薄和當(dāng)時的氣溫條件來選用。一般動物材料用的石蠟熔點為52～56℃；切片薄的用58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時選用52～54℃的，冬季可用熔點46～48℃的，夏季可選56～58℃的。熔點的判定石蠟的熔點石蠟的質(zhì)量將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結(jié)且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點出現(xiàn)，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細(xì)粒。這種石蠟即為品質(zhì)優(yōu)良。新蠟及廢蠟的清潔回收將石蠟放入鍋內(nèi)，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱30min（注意別超過發(fā)火點），使其去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì)，并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。透蠟在恒溫箱中進(jìn)行，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點3度，透蠟的時間依材料性質(zhì)而定，一般每次需15～30min。二甲苯:石蠟（1:1）約30分鐘—石蠟Ⅰ約40-60分鐘—石蠟Ⅱ約40-60分鐘。透蠟的關(guān)鍵是控制溫度的恒定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟?zāi)虩o法滲透，溫度過高使組織收縮發(fā)脆。7.包埋把被石蠟浸透的材料連同熔化的石蠟一起倒入一定形狀的容器內(nèi)，并立即投入冷水中，使它凝固成含材料的蠟塊，以備切片。先準(zhǔn)備好紙盒，將熔蠟倒入盒內(nèi)，迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨?，使其迅速冷卻凝固，30min后取出。注意事項包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度。石蠟的迅速冷卻很重要，否則包埋塊中會產(chǎn)生結(jié)晶，切片時引起碎裂。包埋前應(yīng)先把必需的用具（恒溫箱、溫臺、紙盒、酒精燈）準(zhǔn)備好。包埋用的鑷子要先放在溫箱中預(yù)熱。操作要迅速，如包埋得不好，可將蠟塊溶化，重新浸蠟和包埋。8.石蠟塊的固著與整修固著：用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物（臺木）上，并使組織塊朝外，便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形?？上魅ヒ唤潜阌谠谙瀻献R別切片。9.切片把包埋好的材料塊用切片機(jī)切成所需厚度的切片帶。切片機(jī)是用來作各種組織切片的一種專門設(shè)計的精密機(jī)械，常用的是旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)。它的夾物部分是上下移動前后推進(jìn)的，而夾刀部分則固定不動。切片準(zhǔn)備切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進(jìn)行切削。包埋塊固定在標(biāo)本臺上，使包埋塊外切面與標(biāo)本夾截面平行。上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度，4-10微米。將刀臺移至近標(biāo)本臺處。切片方法右手轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)輪，左手持毛筆在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度（20-30厘米）后，右手停止轉(zhuǎn)動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于襯有黑紙的紙盒內(nèi)（注意：靠刀面的一面較光滑朝下）。

切片速度不宜太快，搖動轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻，搖轉(zhuǎn)速度以每分鐘40-50轉(zhuǎn)為宜。切片完畢，應(yīng)及時用氯仿將切片機(jī)的有關(guān)部分擦凈。切片中存在的問題及補(bǔ)救方法石蠟帶彎曲不直1．石蠟塊上下兩邊不平行2．石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行3．刀口鋒利不一，局部產(chǎn)生差異4．蠟塊的兩邊的硬度不一致5．材料未居蠟塊正中央6．材料大而形不正1．取下臺木，兩邊修平2．調(diào)節(jié)標(biāo)本臺，使兩者平行3．移動刀片，改用新的刀口4．待蠟塊冷卻后再切，或重新包埋5．用刀片切去部分石蠟，使材料居中6．在大的一邊切去少許石蠟原因補(bǔ)救辦法切片分離、不能連成帶狀1．室溫過低2．石蠟過硬3．材料邊緣留蠟太少4．刀的角度不適合1．在切片機(jī)上方開一電燈或提高室溫2．在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指摩擦蠟塊面，開水燙3．重新包埋4．矯正刀的角度切片卷起呈圓筒狀1．室溫過低2．石蠟過硬3．刀口太鈍4．刀的傾角太大切片過薄組織富含纖維結(jié)締組織1．提高室溫2．加軟蠟3．磨刀4．減小傾角5．用毛筆將蠟片攤開壓住，切2—3片即成帶。切片粘附于切片刀，皺摺在一起1．室溫過高2．石蠟過軟3．刀口上留有一層石蠟4．刀口鈍1．降低室溫2．將蠟塊投入冰箱冷凍10min；增加切片厚度；改用硬蠟包埋3．用二甲苯拭去刀口的石蠟4．磨刀或移動刀口切片縱裂原因：

1．刀有缺口

2．石蠟塊中含有顆粒、雜質(zhì)

3．刀口留有碎屑或細(xì)絲

4．組織太硬補(bǔ)救辦法：

1．可移動刀口

2．將顆粒拽去

3．清潔刀口

4．讓包埋塊在溫水中浸泡切片有橫紋原因：

1．刀和臺木的固定螺絲太松

2．刀口傾斜度太大

3．刀口有石蠟屑補(bǔ)救辦法：

1．旋緊螺旋

2．可放平1—2度后再切

3．用氯仿拭去切片厚薄不勻原因：

1．切片機(jī)有毛病

2．夾刀不當(dāng)

3.未旋緊標(biāo)本臺螺旋

4.石蠟塊過硬補(bǔ)救辦法：

1．矯正切片機(jī)裝置

2．對癥治療

3．旋緊螺旋

4．將石蠟塊在溫水中浸泡每張切片厚薄不勻原因：

1．刀口震動，是由于材料過硬

2．刀的傾角太大補(bǔ)救辦法：

1.在蠟塊表面涂一層火棉膠

2．減小傾角材料裂隙破碎或脫落原因：

1．脫水不干凈

2．有透明劑殘留

3．石蠟透入時，溫度過高或時間過長

4．脫水劑和透明劑使組織變硬發(fā)脆

5．材料太硬或太粗補(bǔ)救辦法：

1．無法彌補(bǔ)

2．增加浸蠟時間，重新包埋

3．無法補(bǔ)救

4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六環(huán)等脫水透明

5．在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液切片時發(fā)生沙沙聲原因：

1．組織塊過硬

2．包埋溫度過高

3.材料內(nèi)留有結(jié)晶體補(bǔ)救辦法：

1．浸泡水中軟化

2．無法補(bǔ)救

3．無法補(bǔ)救石蠟塊將蠟帶抬起原因：

1．由于摩擦而產(chǎn)生靜電荷所致

2．石蠟塊上面附有石蠟碎屑

3．刀口上附有石蠟碎屑補(bǔ)救辦法：

1．提高室溫

2．用刀片將碎屑清除

3．用二甲苯或氧仿清除10.貼片和展片切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進(jìn)一步處理，但是切片常有細(xì)小的橫紋，必須經(jīng)展平后才能貼附，否則影響染色和觀察。貼片一般有撈片法和燙板法。撈片法首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時切片都浮在水面上，由于表面張力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，干燥后備用。燙板法將涂有粘片劑的載玻片上涂上水，把已分割好的切片貼上去，再置載玻片于35℃恒定的燙板上讓切片攤干，并傾斜或用吸水紙吸去水分，最后將載玻片再度放燙板上晾干。注意事項載玻片必須潔凈，不能有油污檢驗法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水，若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應(yīng)朝下，否則染色過程中切片容易脫落。11.脫蠟與復(fù)水組織切片是無色透明的，必須進(jìn)行染色后才能觀察到各種微細(xì)結(jié)構(gòu)。染色方法很多，但是染色劑往往是水溶液，因此切片必須經(jīng)過脫蠟而再度復(fù)水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由于切片十分菲薄，處理的時間大大減少，一般每級停留約2～5min。二甲苯——二甲苯——二甲苯/無水乙醇(1/1)——無水乙醇——無水乙醇——95%乙醇——80%乙醇——70%乙醇——50%乙醇——蒸餾水。以上處理各2-5min。12.染色染色是一個復(fù)雜的過程，兼有物理和化學(xué)作用，其中的機(jī)制目前了解得不很清楚。研究細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)的重要組分都有很多現(xiàn)成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應(yīng)，顯示RNA的Brachet反應(yīng)，顯示多糖的PAS反應(yīng)，顯示蛋白質(zhì)的Millon反應(yīng)和顯示某些酶的鈣-鈷法等，可以根據(jù)不同的要求來選用。H-E染色原理蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。H-E染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。蘇木精haematoxylin，hematoxylin，又叫蘇木素，由蘇木中提取的一種酚類化合物，無色棱形晶體，遇光變紅。難溶于冷水和乙醚，易溶于熱水和熱乙醇，溶