免疫細(xì)胞化學(xué)染色在白血病免疫分型和腫瘤細(xì)胞骨髓轉(zhuǎn)移課件

免疫細(xì)胞化學(xué)染色在白血病免疫分型和腫瘤細(xì)胞骨髓轉(zhuǎn)移

鑒定中的應(yīng)用

前言

白血病和腫瘤細(xì)胞骨髓轉(zhuǎn)移的診斷主要靠骨髓細(xì)胞病理學(xué)診斷。骨髓細(xì)胞病理學(xué)診斷的方法主要有細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)對(duì)白血病進(jìn)行分型的準(zhǔn)確性是64%～77%。細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)結(jié)合可使準(zhǔn)確性達(dá)86%[2]

，但對(duì)于AML-M0

、M7、M5a、MAL鑒定有一定的困難。而免疫細(xì)胞化學(xué)染色在一定程度上可以解決此類(lèi)問(wèn)題。

骨髓轉(zhuǎn)移性癌（BMT）原發(fā)于非造血組織的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至骨髓的總稱(chēng)，骨髓不僅是造血組織惡性腫瘤的好發(fā)部位，同時(shí)又是其它惡性腫瘤常轉(zhuǎn)移的部位。腫瘤經(jīng)血行或淋巴管轉(zhuǎn)移到骨髓，有的能找到原發(fā)灶，而有的找不到原發(fā)灶，這就需要在骨髓內(nèi)直接鑒定腫瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)移到骨髓內(nèi)的癌細(xì)胞同血液系統(tǒng)的惡性腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞之間，在形態(tài)上有一定的區(qū)別，而對(duì)于分化較差的癌細(xì)胞其形態(tài)較難辨認(rèn)，易同急性淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴瘤細(xì)胞以及其它的腫瘤細(xì)胞如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎上腺母細(xì)胞瘤等相混淆不易鑒別。轉(zhuǎn)移到骨髓中的腫瘤細(xì)胞無(wú)組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，加之腫瘤細(xì)胞化學(xué)染色缺乏一定的特異性，使轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的鑒定具有一定的困難，也需要用免疫細(xì)胞化學(xué)染色來(lái)解決。二、免疫細(xì)胞化學(xué)染色理論基礎(chǔ)（一）白血病免疫分型

各種血細(xì)胞來(lái)源于多能干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)分化發(fā)育而成為成熟的血細(xì)胞。這些血細(xì)胞在分化發(fā)育過(guò)程中，在其表面出現(xiàn)不同階段的特異性分化抗原，利用各種特異性單克隆抗體和酶聯(lián)免疫方法測(cè)定這些抗原，從而精確測(cè)定細(xì)胞類(lèi)型及不同的分化階段。白血病細(xì)胞具有與其對(duì)應(yīng)的分化抗原,因此利用分化抗原可對(duì)白血病進(jìn)行免疫學(xué)分型。

（二）腫瘤細(xì)胞鑒定腫瘤是由正常細(xì)胞惡變所致，故細(xì)胞膜表面、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)可能存在著與正常相比在質(zhì)或量上明顯異常的物質(zhì)，這些物質(zhì)可以成為抗原，因而可以用特異性抗體通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)。由于來(lái)源于不同組織的腫瘤細(xì)胞因?yàn)槠渌牡鞍踪|(zhì)和酶的不同，利用針對(duì)這些蛋白質(zhì)和酶的各種特異性單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞種類(lèi)鑒別。三實(shí)驗(yàn)方法種類(lèi)（一）儀器法：流式細(xì)胞儀、自動(dòng)免疫染色儀（二）手工法（玻片法）

1根據(jù)二抗標(biāo)記物不同：堿性磷酸酶法、

辣根過(guò)氧化物酶法、熒光法、抗生物素-生物素法等。2根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理：二步法、三步法等。

五、實(shí)驗(yàn)步驟

1.選擇厚薄均勻的骨髓涂片5～6張，根據(jù)需要用免疫組化圈筆在涂片上畫(huà)直徑1.5cm左右的圓圈數(shù)個(gè)。然后將玻片置于95%酒精溶液中固定5～10分鐘或4℃丙酮10分鐘。2.取出玻片用流水沖洗，再用PBS緩沖液沖洗，滴加3%H2O250μl，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育10分鐘。3.PBS沖洗，5分鐘×3。4.滴加非免疫動(dòng)物血清50μl，室溫孵育10

分鐘。5.根據(jù)形態(tài)學(xué)初檢選擇需要標(biāo)記的第一抗體滴在圓圈內(nèi)并做好記號(hào)，然后將玻片置于濕盒內(nèi)室溫下1.5小時(shí)或4℃過(guò)夜。6.PBS沖洗，5分鐘×3六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或細(xì)胞核上出現(xiàn)棕黃色或棕黃色顆粒則為陽(yáng)性，說(shuō)明此細(xì)胞含有針對(duì)所標(biāo)記的單克隆抗體的抗原，如果不顯棕黃色或棕黃色顆粒則為陰性。七、注意事項(xiàng)1.標(biāo)本應(yīng)新鮮，徹底干燥后方能檢測(cè)。通常放置24小時(shí)后檢測(cè),但標(biāo)本采集后應(yīng)在3-4天內(nèi)測(cè)定完畢。若標(biāo)本采集后不能及時(shí)測(cè)定，勿預(yù)先固定和冰箱內(nèi)保存。2.滴加單克隆一抗時(shí)，格外小心避免混淆。3.滴加二抗、顯色劑時(shí)無(wú)需分開(kāi)。4.整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中自固定后標(biāo)本均應(yīng)保持濕潤(rùn)，不能干燥，直至復(fù)染后方能使其干燥。八、常用單克隆抗體及譜系特異性（一）白血病免疫分型常用單克隆抗體T林巴細(xì)胞：CD2

CD3CD5CD7CD8CDlαTCR-αβTCR-γδB林巴細(xì)胞：CD10CD19CD20CD24CD22CD79αCyIgM髓系細(xì)胞：MPOCD13CD14CD15CD64CD65CD68CD118血型糖蛋白A巨核細(xì)胞：PPOCD41CD42CD61HLA-DR非系列特異性：TdTHLA-DRCD34

(二)根據(jù)白血病免疫學(xué)積分系統(tǒng)，將AL分為四型1.急性未分化型白血病（AUL）

髓系和T或B系抗原積分均≤2。2.急性混合細(xì)胞白血病

有三種類(lèi)型：雙表型、雙克隆型和雙系列型。髓系和B或T淋巴系積分均＞2。3.①伴有髓系抗原表達(dá)的ALL（My+ALL）T或B淋巴系積分＞2同時(shí)粒-單系抗原表達(dá)，但積分≤2。②伴有淋巴系抗原表達(dá)的AML（Ly+AML)

髓系積分＞2同時(shí)淋巴系抗原表達(dá)，但積分≤2。4.單表型表達(dá)淋巴系（T或B）者髓系積分為0，表達(dá)髓系者淋巴

系積分為0[5]。

(三)急性髓細(xì)胞白血病微分化型(M0)特點(diǎn)及免疫

表型特點(diǎn):M0為形態(tài)學(xué)不能分型;常規(guī)細(xì)胞化學(xué)染色陰

性;無(wú)Auer小體。免疫表型：髓系分化抗原CD13、CD33、CD14、CD15、CD11b中至少有一種陽(yáng)性。不表達(dá)B系特異性抗原（CD10、CD19、CD22、CD24）和T系特異性抗原（CD2、CD3、CD5）?？杀磉_(dá)無(wú)系列特異性未成熟標(biāo)志CD34、TdT、HLA-DR。（四）鑒定骨髓轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞常用的單克隆抗體1.Cytokertin(Pan)細(xì)胞角蛋白（廣譜）：廣譜細(xì)胞角蛋白CK（AE1/AE3）主要標(biāo)記角化上皮、復(fù)層鱗狀上皮、復(fù)層上皮、增生的角化細(xì)胞和單層上皮，用于鱗癌、各種腺癌、移行細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌等。2.Cytokeratin(HighMW)細(xì)胞角蛋白（高分子量）：簡(jiǎn)稱(chēng)CK高分子。細(xì)胞角蛋白34βE12為高分子量的細(xì)胞角蛋白，主要用于鱗癌的診斷。3.Cytokeratin(lowMW)細(xì)胞角蛋白（低分量）：簡(jiǎn)稱(chēng)CK低分子。細(xì)胞角蛋白35βH11為低分子量的細(xì)胞角蛋白，主要用于腺癌的診斷。10.神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)

主要分布于神經(jīng)元和一些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中,用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的輔助診斷。11.S-100Protein

用于室管膜瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤等的診斷與鑒別診斷。李曉燕，女，29歲住院號(hào)：159299肺科—3床2004年9月15日骨髓片圖片資料崔單雨，女，9歲住院號(hào)：144061小兒科—15床2004年4月5日骨髓片腎上腺母細(xì)胞瘤?神經(jīng)母細(xì)胞瘤？神經(jīng)母細(xì)胞瘤？CD45史夕琴，女，30歲住院號(hào)：161136血液科—8床2004年10月6日骨髓片邵樂(lè)，男，6歲住院號(hào)：160462小兒科—19床2004年9月21日骨髓片韓茂芬，女，57歲住院號(hào)：165004感染科—27床2004年10月6日骨髓片CD7攀勝甫，男，42歲住院號(hào)：166298消化科—4床2004年11月27日骨髓片楊雨甜，女，1歲3個(gè)月住院號(hào)：167108小兒科—13床2004年11月29日骨髓片病例測(cè)定結(jié)果

表1FAB分型25例AML中，形態(tài)學(xué)和免疫組化均符合髓系白血病16例（占64%）；4例（16%）既有髓系又有T系抗原表達(dá)；5例（20%）既有髓系又有B系抗原表達(dá)，與文獻(xiàn)[3]報(bào)道較一致。表1顯示，髓系抗原CD13和CD33，在AML中表達(dá)較高（分別為80%和76）。表125例AMLCD抗原陽(yáng)性表達(dá)情況

表211例ALL患者8種CD抗原表達(dá)顯示，淋系抗原（CD3，CD7，CD19，CD20）在ALL呈高表達(dá)，而髓系抗原（CD13CD14CD33）表達(dá)率低，其中有2例既表達(dá)淋系又表達(dá)髓系抗原。表211例ALLCD抗原陽(yáng)性表達(dá)情況

表33例FAB難分型的白血病，2例髓系表達(dá)并且CD14陽(yáng)性確診為M5b，一例既有T系表達(dá)又有髓系表達(dá)，確診為M+ALL（急性淋巴細(xì)胞性白血病髓系表達(dá)）。表33例FAB不能定型的CD抗原陽(yáng)性表達(dá)情況%

表410例腫瘤細(xì)胞BM轉(zhuǎn)移，其中5例癌細(xì)胞BM轉(zhuǎn)移，4例CK低分子陽(yáng)性，確診為腺癌。1例CK高分子陽(yáng)性確診為鱗癌。4例似診為淋巴瘤BM浸潤(rùn)？惡性組織細(xì)胞病（惡組）待排，2例T系表達(dá)，2例B系表達(dá)，確診為淋巴瘤BM浸潤(rùn)。1例形態(tài)上難以確定是癌還是瘤的，因CK低分子陽(yáng)性，確診為腺癌細(xì)胞。表410例腫瘤細(xì)胞BM轉(zhuǎn)移CD和CK陽(yáng)性表達(dá)情況

病例討論FAB對(duì)急性白血病分型，可將大部分白血病分型，仍有小部分很難定型，尤其是POX染色陰性M0、M5a、L2及MAL。由于白血病細(xì)胞形態(tài)多變性及形態(tài)學(xué)的主觀性，加上有些化學(xué)染色由于試劑質(zhì)量﹑方法等因素也缺乏一定特異性，所以有小部分急性白血病根據(jù)形態(tài)及化學(xué)染色很難定型，特別是M0只能用免疫組化定型。表33例FAB難以定型白血病，其中1例形態(tài)上象M5b，細(xì)胞核明顯扭曲折疊，染色質(zhì)細(xì)致，漿量豐富。M5bPOX染色陽(yáng)性率>3%，但其POX染色100%陰性，PAS染色呈細(xì)小顆粒弱陽(yáng)性，非特異性脂酶染色陰性，而M5b應(yīng)該是陽(yáng)性。所以此例病例是M5b？還是L2？很難定型。但其免疫組化顯示CD14、CD33、CD13陽(yáng)性，不表達(dá)淋系抗原。所以此病例確診為M5b。其它兩例也同此例類(lèi)似。由于CD單抗直接測(cè)定細(xì)胞的分化抗原，且特異性強(qiáng)，所以可以彌補(bǔ)FAB分型的不足。表1和表225例AML和11例ALL免疫表型結(jié)果分析可以看出，急性白血病免疫分型與FAB形態(tài)學(xué)分型有較好的一致性。AML免疫分型與形態(tài)學(xué)分型完全符合者（單純表達(dá)髓系抗原）占64%，ALL免疫分型與形態(tài)學(xué)分型完全符合者（單純表達(dá)淋系抗原）占81%，與文獻(xiàn)報(bào)道[4]基本一致。約36%AML表達(dá)淋系抗原（Ly+M）和18%ALL表達(dá)髓系抗原(M+ALL)。這是因?yàn)檎Ｔ煅杉?xì)胞存在髓系和淋系抗原在其分化過(guò)程中逐漸形成系列專(zhuān)一抗原表達(dá)，而白血病細(xì)胞不能遵循正常造血干細(xì)胞的發(fā)育﹑分化規(guī)律。因而出現(xiàn)抗原表達(dá)的紊亂，表現(xiàn)出免疫標(biāo)志的異質(zhì)性[4]。Ly+AML和ly-AML及M+ALL和M-ALL患者在對(duì)化療的反應(yīng)，預(yù)后等方面有很大差別。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Ly+AML患者較之ly-AML患者對(duì)化療反應(yīng)差，預(yù)后不佳，但M+ALL則無(wú)此特征[4]，因此免疫分型可為臨床制定化療方案和判斷疾病預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。臨床上有些病人腫瘤細(xì)胞BM已經(jīng)轉(zhuǎn)移，但原發(fā)灶有時(shí)很難找到。那么BM轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞的鑒定則成為重要和必須。但從形態(tài)上有時(shí)只能確定是癌或是肉瘤，當(dāng)形態(tài)不典型時(shí)，有時(shí)也不能區(qū)別。而用CK高分子單抗與CK低分子單抗，不僅能區(qū)分鱗癌和腺癌，同時(shí)將腺癌與肉瘤區(qū)分。CK高分子陽(yáng)性是鱗癌，CK低分子陽(yáng)性是腺癌，肉瘤細(xì)胞CK高分子和CK低分子都是陰性。淋巴瘤BM浸潤(rùn)和早期惡組，由于細(xì)胞少，從形態(tài)和化學(xué)染色上很難鑒定，特別易將組織細(xì)胞樣淋巴瘤診斷為惡組。隨著免疫組化和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，對(duì)以前診斷的惡組重新進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)許多所謂的“惡組”病例瘤細(xì)胞并不是組織細(xì)胞源性，而是來(lái)源于其它細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等。第四軍醫(yī)大學(xué)病理教研室對(duì)13例惡性組織細(xì)胞增生癥免疫組織化學(xué)研究結(jié)果,9例T細(xì)胞性淋(CD45RO陽(yáng)性),2例組織細(xì)胞腫瘤(CD68陽(yáng)性),1例雜合表達(dá)(CD45RO和CD68同時(shí)陽(yáng)性),1例T細(xì)胞源性間變性大細(xì)胞淋巴瘤(CD45RO,EMA和CD30陽(yáng)性),無(wú)一例B細(xì)胞或NK細(xì)胞腫瘤(CD20和CD56全部陰性).WHO（2000）分類(lèi)中，為避免混淆，未再提真正的惡性組織細(xì)胞增生癥，而將組織細(xì)胞肉瘤作為單獨(dú)一類(lèi)列出，并提出組織細(xì)胞肉瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）表達(dá)2種或2種以上單核細(xì)胞