第八章 吸光光度法

第8章吸光光度法8.1概述8.2光吸收的基本定律8.3分光光度計8.4顯色反應(yīng)及影響因素8.5吸光光度分析設(shè)計8.6吸光光度法的誤差8.7常用的吸光光度法8.8吸光光度法的應(yīng)用2/6/202318.1概述一、光學(xué)分析法依據(jù)物質(zhì)發(fā)射的電磁輻射或物質(zhì)與電磁輻射相互作用而建立起來的各種分析法的統(tǒng)稱~。二、分類：

1．光譜法：利用物質(zhì)與電磁輻射作用時，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化能級躍遷而產(chǎn)生的吸收、發(fā)射或散射輻射等電磁輻射的強度隨波長變化的定性、定量分析方法。

2/6/20232

按能量交換方向分吸收光譜法發(fā)射光譜法按作用結(jié)果不同分原子光譜→線狀光譜分子光譜→帶狀光譜2．非光譜法：利用物質(zhì)與電磁輻射的相互作用測定電磁輻射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性質(zhì)變化的分析方法分類：折射法、旋光法、比濁法、χ射線衍射法2/6/202333．光譜法與非光譜法的區(qū)別：光譜法：內(nèi)部能級發(fā)生變化

原子吸收/發(fā)射光譜法：原子外層電子能級躍遷分子吸收/發(fā)射光譜法：分子外層電子能級躍遷非光譜法：內(nèi)部能級不發(fā)生變化僅測定電磁輻射性質(zhì)改變?nèi)?、發(fā)射光譜例：γ-射線；x-射線；熒光2/6/20234四、吸收光譜例：原子吸收光譜，分子吸收光譜吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法，屬于分子吸收光譜分析方法基于外層電子躍遷2/6/202358.2光吸收的基本原理8.2.1

吸收光譜產(chǎn)生的原因光:一種電磁波,波粒二象性

光譜名稱波長范圍X射線0.1~10nm遠紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無線電波1～1000m當光子的能量與分子的E匹配時，就會吸收光子

E=hu=hc/l2/6/20236a躍遷類型

價電子躍遷：σ→σ*,π→π*;n→σ*,n→π*

E(h)順序:n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*

有機化合物的生色原理1.σ→σ*躍遷：飽和烴（甲烷，乙烷）

E很高，λ<150nm（遠紫外區(qū)）2.n→σ*躍遷：含雜原子飽和基團（—OH，—NH2）

E較大，λ150~250nm（真空紫外區(qū)）3.π→π*躍遷：不飽和基團（—C＝C—，—C＝O）

E較小，λ~200nm

體系共軛，E更小，λ更大4.n→π*躍遷：含雜原子不飽和基團（—C≡N，C＝O）

E最小，λ200~400nm（近紫外區(qū)）2/6/20237b生色團和助色團

生色團:含有π→π*躍遷的不飽和基團例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—

注：紫外光譜電子躍遷類型：n—π*躍遷

π—π*躍遷飽和化合物無紫外吸收電子躍遷類型與分子結(jié)構(gòu)及存在基團有密切聯(lián)系根據(jù)分子結(jié)構(gòu)→推測可能產(chǎn)生的電子躍遷類型；根據(jù)吸收譜帶波長和電子躍遷類型

→推測分子中可能存在的基團（分子結(jié)構(gòu)鑒定）2/6/20238助色團:含非鍵電子的雜原子基團，如-NH2,-OH,-CH3…

與生色團相連時，會使吸收峰紅移，吸收強度增強例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X2/6/20239物質(zhì)的顏色吸收光顏色波長范圍(l,nm)黃綠黃橙紅紫紅紫藍綠藍藍綠紫藍綠藍藍綠綠黃綠黃橙紅400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-7508.2.2

物質(zhì)顏色和其吸收光關(guān)系互補色2/6/2023108.2.3

朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理論依據(jù)，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度朗伯定律（1760年）：光吸收與溶液層厚度成正比比爾定律（1852年）：光吸收與溶液濃度成正比2/6/202311當一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系－－－朗伯比爾定律－－－光吸收定律

數(shù)學(xué)表達：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比，

K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度注意：平行單色光均相介質(zhì)無發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)2/6/202312摩爾吸光系數(shù)e靈敏度表示方法A=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)c:g/LA=abca:吸光系數(shù)2/6/202313桑德爾(Sandell)靈敏度：S

當儀器檢測吸光度為0.001時，單位截面積光程內(nèi)所能檢測到的吸光物質(zhì)的最低含量。單位：mg/cm2

S=M/e

2/6/202314氯磺酚S測定鋼中的鈮

50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm測定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有兩種做法：根據(jù)A=εbc,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

2/6/202315吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A

=e1bc1+e2bc2

根據(jù)吸光度的加和性可以進行多組分的測定以及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測定在某一波長，溶液中含有對該波長的光產(chǎn)生吸收的多種物質(zhì)，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個吸光物質(zhì)的吸光度之和2/6/202316光源單色器樣品池檢測器讀出系統(tǒng)8.3吸光光度計及吸收光譜8.3.1分光光度計2/6/202317常用光源光源波長范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段2/6/202318單色器作用:產(chǎn)生單色光常用的單色器：棱鏡和光柵樣品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿－－可見光區(qū)石英比色皿－－可見、紫外光區(qū)2/6/202319檢測器

作用：接收透射光，并將光信號轉(zhuǎn)化為電信號常用檢測器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長2/6/202320目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計

光源、濾光片、比色池、硒光電池、檢流計分光光度法與分光光度計

722型分光光度計光學(xué)系統(tǒng)圖1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準直鏡；6.光柵9.比色池；10.光電管2/6/2023218.3.2吸收光譜吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長下吸收光的強度大小

A～l關(guān)系1．吸收光譜（吸收曲線）：不同波長光對樣品作用不同，吸收強度不同以λ~A作圖2．吸收光譜特征：定性依據(jù)

吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→飽和σ-σ躍遷產(chǎn)生2/6/2023222/6/2023238.4顯色反應(yīng)及影響因素沒有顏色的化合物，需要通過適當?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測定－－顯色反應(yīng)8.4.1顯色反應(yīng)和顯色劑1顯色反應(yīng)絡(luò)合反應(yīng)偶氮胂III2/6/202324氧化還原反應(yīng)離子締合反應(yīng)2/6/202325成鹽反應(yīng)褪色反應(yīng)

Zr(IV)-偶氮胂III絡(luò)合物測定草酸2/6/202326吸附顯色反應(yīng)

達旦黃測定Mg(II),Mg(OH)2吸附達旦黃呈紅色對顯色反應(yīng)的要求：a.選擇性好b.靈敏度高

(ε>104)c.產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e.反應(yīng)物和產(chǎn)物有明顯的顏色差別

(l>60nm)2/6/2023272顯色劑無機顯色劑:

過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機顯色劑：偶氮類：偶氮胂III2/6/202328三苯甲烷類三苯甲烷酸性染料鉻天菁S三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫

2/6/202329鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟2/6/2023303多元絡(luò)合物混配化合物

Nb-5-Br-PADAP-酒石酸

V-PAR-H2O離子締合物

AuCl4--羅丹明B金屬離子-配體-表面活性劑體系

Mo-水楊基熒光酮-CTMAB2/6/2023318.4.2影響顯色反應(yīng)的因素1溶液酸度（pH值及緩沖溶液）影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變Δl

影響待測離子的存在狀態(tài)，防止沉淀

影響絡(luò)合物組成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH對苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響2/6/2023322顯色劑的用量稍過量，處于平臺區(qū)3顯色反應(yīng)時間針對不同顯色反應(yīng)確定顯示時間顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定；顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定4顯色反應(yīng)溫度加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解2/6/2023335溶劑6干擾離子

有機溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除辦法：提高酸度，加入隱蔽劑，改變價態(tài)選擇合適參比

褪色空白(鉻天菁S測Al，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾)

選擇適當波長2/6/2023348.5吸光光度分析設(shè)計

選擇檢測波長

選擇合適的濃度選擇參比溶液建立標準曲線測量條件選擇2/6/2023358.5.1

吸光度測量的條件選擇1測量波長的選擇:但如果λmax處有共存組分干擾時，則應(yīng)考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。吸光度測定條件的選擇曲線A為鈷絡(luò)合物的吸收曲線曲線B為顯色劑的吸收曲線2/6/202336注：采用空白對比消除因溶劑和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素對透光率的干擾選A=0.2~0.82吸光度讀數(shù)范圍的選擇：3參比溶液(空白溶液)的選擇：2/6/202337參比溶液的選擇一般遵循以下原則：溶液代號在測定波長處有無吸收試液1無無干擾有干擾有顯色劑2無有無有其它所加試劑3無有無有（或無）參比溶液2+3或（水)2+31(1+掩蔽)后+2+32/6/2023388.5.2標準曲線制作理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律相同條件下測定不同濃度標準溶液的吸光度AA～c作圖2/6/2023398.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測量的誤差

對朗伯-比爾定律的偏移2/6/2023408.6.1非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時線性關(guān)系向下彎曲。2/6/202341非均勻介質(zhì)

膠體，懸浮、乳濁等對光產(chǎn)生散射，使實測吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎8.6.2物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-化學(xué)反應(yīng)2/6/2023422/6/2023438.6.3吸光度測量的誤差2/6/202344若不再此范圍：1、改變比色池厚度

2、改變待測液濃度2/6/202345示差吸光光度法目的：提高光度分析的準確度和精密度解決高(低)濃度組分(i.e.A在0.2~0.8以外)問題分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法特點：以標準溶液作空白原理：A相對

=A=bcx-bc0=bc準確度：讀數(shù)標尺擴展,相對誤差減少,

c0愈接近cx,準確度提高愈顯著8.7常用的吸光光度法2/6/202346示差分光光度法（示差法）原理

示差法需要較大的入射光強度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標準溶液作參比溶液。設(shè)：待測溶液濃度為cx，標準溶液濃度為cs(cs<cx)。則：

Ax=bcx

As=bcs

ΔＡ＝Ａx

－Ａs=b(cx－cs）=bΔc

2/6/202347

示差法測得的吸光度與Δc呈直線關(guān)系。由標準曲線上查得相應(yīng)的Δc值，則待測溶液濃度cx：

cx=cx測

+Δc示差法標尺擴展原理：T/%Tr/%普通法：cs的T=10%；cx的T=5%示差法：cs做參比,調(diào)T=100%則cx的T=50%；標尺擴展10倍2/6/202348

例：在某光度法測定中，以有色物質(zhì)的純?nèi)軇┳鰠⒈葴y得A1=bc1

。若以濃度為cs

的該有色溶液做參比，測得A2=bc2。則該有色物質(zhì)濃度c1

的計算式為:

A2=b(c1cs)2/6/202349用示差分光光度法進行分析測定，以純?nèi)軇┳鰠⒈葧r,某稍低于試液濃度(cx)的標準溶液(cs)的透光度為20%,而試液的透光度為12%。今以上述標準溶液調(diào)節(jié)儀器的透光度為100%,則試液的透光度將為

60%,這等于將儀器的標尺擴大了

5倍。2/6/2023508.8吸光光度法的應(yīng)用1測定弱酸和弱堿的離解常數(shù)

AHB和AB-分別為有機弱酸HB在強酸和強堿性時的吸光度，它們此時分別全部以[HB]或[B-]形式存在。HB＝H++B-[H+][B-]Ka

=[HB]pKa=pH+lg

[HB][B-]A=AHB+AB-pKa=pH+lg

AB-

-AA-AHBlg

AB--AA-AHB對pH作圖即可求得pKa

2/6/2023512/6/2023522絡(luò)合物組成確定

飽和法（摩爾比法）制備一系列含釕3.0×10-5mol/L(固定