載體教案資料

載體載體的功能及特征載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)按克隆載體的來(lái)源分： 質(zhì)粒～ 病毒或噬菌體～ 質(zhì)粒與病毒或噬菌體DNA組成的～ 質(zhì)粒與染色體DNA片段組成的～按應(yīng)用范圍分：表達(dá)型～啟動(dòng)子探針型～cDNA～按應(yīng)用對(duì)象分：原核生物～植物～動(dòng)物～

分類質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid構(gòu)型：l-DNAoc-DNAccc-DNA質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合oriE.coliColE1

plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’

cop基因：指令宿主合成阻遏物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定拷貝數(shù)時(shí)，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復(fù)制。質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制rep基因：指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制par序列：附著在細(xì)胞膜上，使質(zhì)粒隨細(xì)胞分裂而正確地分配到子細(xì)胞中，維持相對(duì)穩(wěn)定的拷貝數(shù)控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由bom和mob基因決定質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義質(zhì)粒載體的命名pBR322plasmid作者或?qū)嶒?yàn)室名稱F.Bolivar,R.L.Rodriguez質(zhì)粒的編號(hào)（1）分子量大，拷貝數(shù)低質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.天然質(zhì)粒的局限性第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子大小9.1kb。有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr作為篩選標(biāo)志。ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。（2）篩選標(biāo)志不理想可以通過(guò)插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞…….colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（ORI）良好的質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。用來(lái)插入外源DNA片斷，且插入后不影響復(fù)制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。構(gòu)建質(zhì)粒載體的指導(dǎo)思想(1)刪除不必要的DNA區(qū)域。(2)增加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。(3)加入易于檢出的選擇性標(biāo)記，便于檢測(cè)含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。(4)關(guān)于質(zhì)粒安全性能的改造。(5)改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）

質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及原理①抗菌素抗性絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：（1）選擇標(biāo)記②

遺傳標(biāo)記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。質(zhì)粒質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來(lái)自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測(cè)序質(zhì)粒含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報(bào)告基因便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因pBR322：（1）元件來(lái)源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。①?gòu)?fù)制起點(diǎn)oripMB1系列（來(lái)源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）長(zhǎng)度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個(gè)克隆位點(diǎn)。質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測(cè)序裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’用于外源基因的高效表達(dá)注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等TA克隆載體——針對(duì)PCR產(chǎn)物的克隆原理

PCR產(chǎn)物在Taq酶的非模板依賴活性 作用下，于3`端加一非配對(duì)的A。 故可研制一種線性載體，其5`端各帶一不配對(duì)T，可直接與PCR產(chǎn)物以TA連接進(jìn)行克隆，即TA克隆。TA載體的再生方法（1）克隆載體線性化（2）克隆載體末端補(bǔ)平反應(yīng)（3）克隆載體末端加T反應(yīng)注：再生后的TA載體，原線性化的酶切位點(diǎn)消失質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便沸水浴法

質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開(kāi)發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因l噬菌體生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

感染周期體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開(kāi)放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長(zhǎng)度10kb（51–26）載體長(zhǎng)度26kb插入片段最大裝載長(zhǎng)度25kb（36–26）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長(zhǎng)抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)

用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒

密度已達(dá)1013-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解

超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉淀l-DNA

噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便

l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)

外源基因噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)

噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的構(gòu)建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡(jiǎn)便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb噬菌體或病毒DNA與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病

毒基因組DNA。動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類：?jiǎn)捂淒NA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，

考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長(zhǎng)度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒?？妓官|(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb考斯質(zhì)粒與噬菌粒考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選