載體教案資料

載體載體的功能及特征載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點按克隆載體的來源分： 質(zhì)?！?病毒或噬菌體～ 質(zhì)粒與病毒或噬菌體DNA組成的～ 質(zhì)粒與染色體DNA片段組成的～按應用范圍分：表達型～啟動子探針型～cDNA～按應用對象分：原核生物～植物～動物～

分類質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見于原核細菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復制性質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制質(zhì)粒DNA上的復制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應關(guān)系根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲椭祁愋停簢谰o型復制控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復制控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid構(gòu)型：l-DNAoc-DNAccc-DNA質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復制性：拷貝數(shù)的控制機制–質(zhì)粒DNA復制啟動控制控制復制引物與模板的結(jié)合oriE.coliColE1

plasmid復制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’

cop基因：指令宿主合成阻遏物，當質(zhì)粒復制到一定拷貝數(shù)時，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復制。質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復制性：拷貝數(shù)的控制機制–質(zhì)粒DNA復制啟動控制rep基因：指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進質(zhì)粒的復制par序列：附著在細胞膜上，使質(zhì)粒隨細胞分裂而正確地分配到子細胞中，維持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)控制復制起始因子與復制起始位點（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性：分子機制兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由bom和mob基因決定質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征攜帶特殊的遺傳標記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質(zhì)合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義質(zhì)粒載體的命名pBR322plasmid作者或?qū)嶒炇颐QF.Bolivar,R.L.Rodriguez質(zhì)粒的編號（1）分子量大，拷貝數(shù)低質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.天然質(zhì)粒的局限性第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子大小9.1kb。有多個限制性酶切位點充當克隆位點，Tetr作為篩選標志。ColE1質(zhì)粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。（2）篩選標志不理想可以通過插入失活篩選。但細菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細胞…….colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內(nèi)部。（1）具有復制起點（ORI）良好的質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點：是篩選的標志。理想的載體應該有兩種抗菌素抗性基因。用來插入外源DNA片斷，且插入后不影響復制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。構(gòu)建質(zhì)粒載體的指導思想(1)刪除不必要的DNA區(qū)域。(2)增加限制性內(nèi)切酶酶切位點。(3)加入易于檢出的選擇性標記，便于檢測含有重組質(zhì)粒的受體細胞。(4)關(guān)于質(zhì)粒安全性能的改造。(5)改造或增加基因表達的調(diào)控序列。氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）

質(zhì)粒的選擇標記及原理①抗菌素抗性絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標記：（1）選擇標記②

遺傳標記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。質(zhì)粒質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴增基因低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進基因及位點便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對兩種不同受體的復制子便于基因克隆表達質(zhì)粒裝有強化外源基因表達的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復制pBR322：氯霉素可擴增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因pBR322：（1）元件來源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。①復制起點oripMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復制起點②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）長度4363bp（3）選擇標記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點其中9個會導致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個會導致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個克隆位點。質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個噬菌體的強啟動子裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’用于外源基因的高效表達注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等TA克隆載體——針對PCR產(chǎn)物的克隆原理

PCR產(chǎn)物在Taq酶的非模板依賴活性 作用下，于3`端加一非配對的A。 故可研制一種線性載體，其5`端各帶一不配對T，可直接與PCR產(chǎn)物以TA連接進行克隆，即TA克隆。TA載體的再生方法（1）克隆載體線性化（2）克隆載體末端補平反應（3）克隆載體末端加T反應注：再生后的TA載體，原線性化的酶切位點消失質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法

質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學特性：

生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因l噬菌體生物學特性：

生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：

感染周期E.coli吸附LamB受體注入復制包裝裂解噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：

感染周期體內(nèi)包裝100個左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：

溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進入溶菌狀態(tài)噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復的酶切位點野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除至1-2個同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術(shù)去除或增添酶位點噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標記，因此加裝選擇標記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標記主要有下列兩類：免疫功能類標記顏色反應類標記噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標記imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標記基因的l-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當外源DNA插入到標記基因中，基因滅活，l-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。當外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍色透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當這種l-DNA進入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計的噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時

用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時。這時噬菌體顆粒

密度已達1013-1014/L，大腸桿菌細胞已完全裂解

超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉淀l-DNA

噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA作為載體的優(yōu)點：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡便

l-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達

外源基因噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13噬菌體的生物學特性：

生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長6407個核苷酸M13DNA上至少有10個基因2700個外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長

噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13噬菌體的生物學特性：

感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13DNA載體的構(gòu)建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13DNA載體的特點：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb噬菌體或病毒DNA與動植物受體細胞相適應的載體一般選擇相應動植物的病

毒基因組DNA。動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動植物病毒分成四大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復制時大多存在相應的DNA中間反應物，這些中間體可作為載體進行常規(guī)的DNA重組?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，

考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒?？妓官|(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型的載體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點：能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選