流感病毒實驗室檢測方法的對比分析備課講稿

流感病毒實驗室檢測方法的對比(duìbǐ)分析研究生：樊衡第一頁，共17頁。流感病毒概述(ɡàishù)正粘病毒科，RNA病毒。感染對象：人、豬、馬以及禽類。核蛋白抗原性:甲型（A型）、乙型（B型）、丙型（C型）。甲流病毒根據(jù)(gēnjù)H抗原（血凝素）和N抗原（神經(jīng)氨酸酶）分亞型，H有17個亞型，N有10個亞型，乙型流感病毒分Victoria和Yamagata系。感染人的流感病毒：H1N1、H3N2，Victoria和Yamagata系。對乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒劑敏感；對紫外線和熱敏感，56℃條件下30分鐘可滅活。第二頁，共17頁。流感病毒結(jié)構(gòu)(jiégòu)模式圖流感病毒電鏡圖第三頁，共17頁。楊靜,陳濤,祝菲,etal.2017～2018年度中國大陸流行性感冒(gǎnmào)病例報告情況分析[J].熱帶病與寄生蟲學(xué),2018(2).2014-2018年4個監(jiān)測年度流感病例時間(shíjiān)分布2017-2018全國各地區(qū)發(fā)病(fābìng)數(shù)地區(qū)分布全國流感流行分析第四頁，共17頁。致病機制(jīzhì)1、血凝素結(jié)合呼吸道上皮含有唾液酸受體的細胞(xìbāo)2、內(nèi)吞作用進入細胞(xìbāo)3、病毒基因組在細胞(xìbāo)核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄復(fù)制（8h）4、呼吸道黏膜擴散并感染其他細胞(xìbāo)5、誘發(fā)細胞(xìbāo)因子風(fēng)暴、全身炎癥反應(yīng)、ARDS、休克及多臟器功能衰竭。流行性感冒診療方案（2018年版）[J].中國(zhōnɡɡuó)感染控制雜志,2018.第五頁，共17頁。潛伏期末到發(fā)病的急性期均有傳染性。臨床癥狀出現(xiàn)前24-48小時即可排出(páichū)病毒，排毒量在0.5-1天顯著增加，發(fā)病后24小時內(nèi)達到高峰。成人和較大年齡兒童一般持續(xù)排毒5天（3-8天），低齡兒童發(fā)病時的排毒量與成人相同，但排毒時間更長。嬰幼兒長期排毒很常見（1-3周）。研究證實，抗病毒藥物需在癥狀出現(xiàn)后的36～48h內(nèi)使用獲取最大療效。秦強,徐保平.流行性感冒診療方案(fāngàn)（2018年版）解讀[J].中國臨床醫(yī)生雜志,2018.第六頁，共17頁。流感病毒實驗室檢測(jiǎncè)的方法（1）血清學(xué)檢測：血清IgM和IgG抗體。（2）病毒抗原檢測（快速診斷試劑檢測）：檢測核蛋白。免疫酶法、免疫膠體金和免疫熒光法。（3）病毒核酸檢測：檢測病毒的RNA。RT-PCR法（常規(guī)、熒光、套式、多重PCR、PCR-RFLP、RRT-PCR）、實時熒光定量PCR法、依賴核酸序列的擴增法(NASBA)、介導(dǎo)等溫擴增法(LAMP)、焦磷酸測序法、基因芯片技術(shù)。特異性和敏感性最好，且能區(qū)分病毒類型和亞型。（4）病毒分離培養(yǎng)：使用雞胚或傳代細胞培養(yǎng)分離病毒，是流感病毒鑒定的金標(biāo)準(biāozhǔn)，但靈敏度低、培養(yǎng)時間長、對實驗室條件和實驗人員的技術(shù)要求高。

薛文仲,張斌,王中強,etal.流感病毒的檢測和分型技術(shù)研究進展[J].生物技術(shù)通訊,2011,22(4):559-563.流行性感冒診療方案（2018年版）[J].中國感染控制雜志,2018.田燕,梁潔,陸志剛.流感病毒不同檢測方法的探討(tàntǎo)[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013,40(20):130-130.第七頁，共17頁。血清學(xué)檢測(jiǎncè)檢測患者血清中的抗體水平。采集急性期、恢復(fù)期雙份血清，通過血凝抑制實驗、補體結(jié)合實驗、微量中和實驗檢測抗體滴度，若恢復(fù)期抗體滴度比急性期上升4倍或4倍以上，便可診斷為流感。急性期血清需在癥狀出現(xiàn)(chūxiàn)后盡快收集，恢復(fù)期血清則在2～4周后采集。用于回顧性診斷研究，監(jiān)測流感病毒流行趨勢的作用。第八頁，共17頁。標(biāo)本(biāoběn)鼻咽抽吸物(洗液)、支氣管肺泡灌洗液、咳出的痰、后鼻(喉)拭子、鼻咽拭子、口咽拭子等。抽吸物或洗液、灌洗液優(yōu)于拭子標(biāo)本，因為拭子、痰標(biāo)本中含有較少的柱狀上皮細胞(流感病毒感染柱狀上皮細胞并在其中繁殖(fánzhí))而含有更多的鱗狀上皮細胞。拭子標(biāo)本易于采集，往往在臨床上是首選。第九頁，共17頁。抗原(kàngyuán)與核酸檢測對比Rebeloh等利用病毒分離、EIA（免疫酶法）、RT-PCR對流感的暴發(fā)(bàofā)流行進行診斷并比較，RT-PCT法比EIA法靈敏，并和地區(qū)流感暴發(fā)(bàofā)流行具有良好的相關(guān)性。RebelodeandradeH,ZambonMC.Differentdiagnosticmethodsfordetectionofinfluenzaepidemics.[J].Epidemiology&Infection,2000,124(3):515-522.第十頁，共17頁?？乖c核酸(hésuān)檢測對比Plakokefalose等用ELISA和RT-PCR對甲型、乙型流感病毒進行診斷(zhěnduàn)，ELISA和RT-PCR的敏感性分別是64％和100％，特異性分別是98％和97％。PlakokefalosE,MarkoulatosP，KtenasE,etal.AcomparativestudyofimmunocaptureELISAandRT-PCRforscreeningclinicalsamplesfromSouthernGreeceforhumaninfluenzavirustypesAandB[J].JournalofMedicalMicrobiology,2000,49(11):1037.第十一頁，共17頁?？乖?kàngyuán)與核酸檢測對比鼻咽拭子標(biāo)本或口咽拭子標(biāo)本檢測甲型流感(liúɡǎn)時，用核酸方法檢測的陽性率高，且敏感度也高于抗原方法，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。不管核酸方法和抗原方法，鼻咽拭子的陽性率高于口咽拭子?？赡茉颍孩僭诒茄什坎杉闹鶢钌掀ぜ毎喽[狀上皮細胞少；②采集標(biāo)本時拭子觸及舌部被唾液中的溶菌酶污染所致；③含藻酸鈣的拭子或木柄拭子含有可抑制PCR或使病毒失活的物質(zhì)。張欣,閆惠平,馬胤雪,etal.不同方法檢測(jiǎncè)流行性感冒樣病例鼻咽和口咽拭子標(biāo)本診斷甲型流行性感冒的評價[J].中華傳染病雜志,2011,29(3):154-157.第十二頁，共17頁。PCR檢測敏感性高于抗原(kàngyuán)檢測的原因主要原因：PCR法在病毒(bìngdú)含量低時經(jīng)擴增仍能檢出其RNA，抗原檢測在病毒(bìngdú)含量較低（抗原載量低）時達不到陽性檢出限。其他原因：與檢測技術(shù)、標(biāo)本類型不同或檢測方法及試劑不同有關(guān)。田燕,梁潔,陸志剛.流感病毒不同檢測方法的探討(tàntǎo)[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013,40(20):130-130.張欣,閆惠平,馬胤雪,etal.不同方法檢測流行性感冒樣病例鼻咽和口咽拭子標(biāo)本診斷甲型流行性感冒的評價[J].中華傳染病雜志,2011,29(3):154-157.第十三頁，共17頁。PCR檢測敏感性高于抗原(kàngyuán)檢測的原因以病毒培養(yǎng)或RT—PCR法作為金標(biāo)準(biāozhǔn)檢測甲、乙型流感時，快速抗原方法(美國Quidel公司生產(chǎn))檢測鼻咽拭子的敏感度最高(85％)、其次是鼻拭子(78％)、鼻洗液(69％)，特異度均達97％。3種不同的試劑在檢測(jiǎncè)甲型H1N1(2009)流感患者鼻咽拭子時的敏感度也各不相同，以Quidel公司檢測(jiǎncè)的敏感度最高，達53％。AgoritsasK,MackK,BonsuBK,etal.EvaluationoftheQuidelQuickVueTestforDetectionofInfluenzaAandBVirusesinthePediatricEmergencyMedicineSettingbyUseofThreeSpecimenCollectionMethods[J].JournalofClinicalMicrobiology,2006,44(7):2638-2641.VasooS,StevensJ,SinghK.RapidAntigenTestsforDiagnosisofPandemic(Swine)InfluenzaA/H1N1[J].ClinicalInfectiousDiseases,2009,49(7):1090-1093.第十四頁，共17頁。檢測(jiǎncè)結(jié)果判讀核酸檢測陽性：結(jié)合癥狀確診流感病毒感染?？乖瓩z測陽性結(jié)果：結(jié)合癥狀臨床診斷病毒感染?？乖瓩z測陰性結(jié)果：不能完全排除流感病毒感染。假陰性：①病毒含量低；②靶表位區(qū)氨基酸的微小改變都可能造成單克隆抗體不能檢測或檢測敏感性下降；③受稀釋比例、結(jié)果判讀時間長短以及主觀判斷結(jié)果等不確定的因素影響。建議核酸檢測：抗原陽性但無癥狀，有癥狀但抗原陰性。用藥后癥狀消失抗原陽性。