第21章臨床生化檢驗(yàn)方法與試劑盒評價(jià)

第二十一章

臨床生化檢驗(yàn)方法與試劑盒評價(jià)第1頁教學(xué)目標(biāo)與要求

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掌握校準(zhǔn)品的分類和正確使用；測定系統(tǒng)的概念和比對；試劑盒的性能指標(biāo)和評價(jià)方法。

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熟悉方法學(xué)性能指標(biāo)和評價(jià)；量值溯源和量值傳遞的概念；液體雙試劑的優(yōu)點(diǎn)。

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了解試劑盒的分類和發(fā)展趨勢。2第3頁第3頁臨床生化檢驗(yàn)方法的性能評價(jià)臨床生化檢驗(yàn)試劑盒的性能評價(jià)

臨床生化檢驗(yàn)方法分級和標(biāo)準(zhǔn)品

主要內(nèi)容3臨床生化檢驗(yàn)方法分級

一

二

三第一節(jié)臨床生化檢驗(yàn)方法分級和標(biāo)準(zhǔn)品

臨床生化檢驗(yàn)的參考物質(zhì)和校準(zhǔn)品

量值溯源檢測系統(tǒng)的比對

四4

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是指準(zhǔn)確度最高，系統(tǒng)誤差最小，經(jīng)過詳細(xì)的研究，沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生誤差的原因或在某些方面不夠明確的方法。決定性方法參考方法

是指準(zhǔn)確度與精密度已經(jīng)充分證實(shí)的分析方法，干擾因素少，系統(tǒng)誤差與重復(fù)測定的隨機(jī)誤差相比可以忽略不計(jì)，有適當(dāng)?shù)撵`敏度、特異性及較寬的分析范圍。常規(guī)方法

是指性能指標(biāo)符合臨床或其他目的需要，有足夠的精密度、準(zhǔn)確度、特異性和適當(dāng)?shù)姆治龇秶?，而且?jīng)濟(jì)實(shí)用。

一臨床生化檢驗(yàn)方法分級5決定性方法（definitivemethod）也稱為一級參考方法（primaryreferencemethod)參考方法（referencemethod）也稱為二級參考方法（secondaryreferencemethod）常規(guī)方法（routinemethod）；推薦方法（recommendedmethod）6表21-1臨床生化檢驗(yàn)項(xiàng)目的決定性方法、參考方法、常規(guī)方法項(xiàng)目決定性方法參考方法

常規(guī)方法鈣ID-MS原子吸收分光光度法鄰甲酚酞絡(luò)合酮法、MTB法氯ID-MS、中子活化法電流滴定法硫氰酸汞法、選擇性電極法鎂ID-MS原子吸收分光光度法MTB法鉀ID-MS、中子活化法火焰光度法離子選擇電極法、火焰光度法鈉中子活化法火焰光度法離子選擇電極法、火焰光度法清蛋白-免疫化學(xué)法溴甲酚綠法總蛋白-凱氏定氮法雙縮脲法肌肝ID-MS離子交換層析法苦味酸法、酶法尿素ID-MS尿素酶法二乙酰一肟法、酶法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外）磷鎢酸比色法膽紅素-重氮反應(yīng)法J-G法、釩酸鹽氧化法葡萄糖ID-MS已糖激酶法葡萄糖氧化酶法膽固醇ID-MSAbell-Kendall法酶法甘酒三脂ID-MS變色酸顯色法酶法7

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`（primaryreferencematerials）也稱一級標(biāo)準(zhǔn)品，與決定性方法平行，用于驗(yàn)證決定性方法、評價(jià)與校準(zhǔn)參考方法，以及為二級標(biāo)準(zhǔn)品定值。

原級參考物質(zhì)次級參考物質(zhì)

（secondaryreferencematerials）也稱二級標(biāo)準(zhǔn)品，二級標(biāo)準(zhǔn)品的定值源于一級標(biāo)準(zhǔn)品和參考方法，主要用于評價(jià)常規(guī)方法，也可為質(zhì)控物定值。

常規(guī)校準(zhǔn)品

校準(zhǔn)（calibration）指的是對由儀器、方法和試劑所組成的檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)過程。電解質(zhì)、酶類、其他生化指標(biāo)應(yīng)合理選擇校準(zhǔn)品二臨床生化檢驗(yàn)的參考物質(zhì)和校準(zhǔn)品

8標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)品質(zhì)控品一級標(biāo)準(zhǔn)品用高純化學(xué)物質(zhì)（純度>99.98%）直接通過稱重配制的溶液，是唯一值。一般由國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量局出具證書。二級標(biāo)準(zhǔn)品某種成分的濃度可用公認(rèn)的參考方法測定。由參考實(shí)驗(yàn)室或權(quán)威學(xué)術(shù)組織出具證書，如SRM、BCR、IFCC。標(biāo)準(zhǔn)品(standard）可用做校準(zhǔn)品（calibrater），考慮血清成分復(fù)雜、難以避免基質(zhì)效應(yīng)，建議用與新鮮血清相似的介質(zhì)做校準(zhǔn)品，一般由試劑盒供應(yīng)商提供和賦值。校準(zhǔn)品的量值應(yīng)有溯源性，不同測定系統(tǒng)賦值不同。質(zhì)控品多是成分相對穩(wěn)定的混合血清，分為定值和非定值、凍干或液體，添加了防腐劑和保護(hù)劑等。定值往往由試劑盒供應(yīng)商委托幾家實(shí)驗(yàn)室在特定測定系統(tǒng)上測得的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。9標(biāo)準(zhǔn)品與校準(zhǔn)品大多數(shù)定量的方法（分光光度法、電化學(xué)、免疫定量）都需要用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)，即通過標(biāo)準(zhǔn)比較來計(jì)算。校準(zhǔn)是這些方法定量必經(jīng)的過程。用什么“標(biāo)準(zhǔn)”來校準(zhǔn)？羅氏公司的C.f.a.s（calibratorforautomationsystem），屬于多項(xiàng)校準(zhǔn)品，因使用方便，很多實(shí)驗(yàn)室都在使用。但前提是“指定的測定系統(tǒng)”。10圖21-1各級參考物質(zhì)和校準(zhǔn)品的關(guān)系及其量值傳遞過程11三量值溯源溯源性(traceability）是指通過一條具有規(guī)定不確定度（uncertainty）的不間斷的比較鏈，使測量結(jié)果或測量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)（通常是國家或國際測量標(biāo)準(zhǔn)）聯(lián)系起來的特性，稱為溯源性。其不間斷的比較鏈稱為溯源鏈。溯源性12測量不確定度測量不確定度是指表征合理地賦予被測之值的分散性。是與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，可理解為排除系統(tǒng)誤差之外的所有隨機(jī)誤差的合成方差。13圖21-2量值溯源和量值傳遞途徑14四檢測系統(tǒng)的比對完成一個(gè)項(xiàng)目檢驗(yàn)所涉及的儀器、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、操作程序、質(zhì)量控制、保養(yǎng)計(jì)劃等的組合稱為檢測系統(tǒng)（testingsystem）。常規(guī)檢測系統(tǒng)有配套檢測系統(tǒng)和自建檢測系統(tǒng)。（一）檢測系統(tǒng)的概念15

.配套檢測系統(tǒng)

自建檢測系統(tǒng)

（二）檢測系統(tǒng)的分類整個(gè)檢測系統(tǒng)涉及的各個(gè)部分完全按照指定廠商要求配套使用。若該系統(tǒng)已經(jīng)國家法定部門認(rèn)證,則使用這樣的檢測系統(tǒng)對臨床樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，其結(jié)果具溯源性。實(shí)驗(yàn)室自行建立的檢測系統(tǒng)，如A制造商的試劑盒、B制造商的校準(zhǔn)品、C制造商分析儀的組合。16①制訂分析質(zhì)量目標(biāo)

②儀器性能評價(jià)

③確定對比檢測系統(tǒng)

內(nèi)容④初步評價(jià)檢測系統(tǒng)⑤比對允許不精密度、允許偏倚和允許總誤差準(zhǔn)確度和精密度

參考系統(tǒng)或公認(rèn)的測定系統(tǒng)性能指標(biāo)40-100例（二）檢測系統(tǒng)比對的實(shí)施步驟可接受性判斷步驟17第18頁測定系統(tǒng)方法學(xué)操作程序校準(zhǔn)品儀器試劑配方和來源測定系統(tǒng)的關(guān)鍵要素18第19頁

1

2統(tǒng)一方法：以方法學(xué)評價(jià)為基礎(chǔ)，提出參考方法或推薦方法。統(tǒng)一試劑的主要成分和測定條件。實(shí)施機(jī)構(gòu)：國際臨床化學(xué)學(xué)會、臨檢中心逐級溯源：常規(guī)校準(zhǔn)品應(yīng)向二級標(biāo)準(zhǔn)品、一級標(biāo)準(zhǔn)溯源。實(shí)施機(jī)構(gòu)：ISO、國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量局、參考實(shí)驗(yàn)室、試劑盒供應(yīng)商、臨床實(shí)驗(yàn)室全球性可比性戰(zhàn)略實(shí)施33保證儀器良好的工作狀態(tài)、嚴(yán)格的操作規(guī)程和質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部測定系統(tǒng)的比對、實(shí)驗(yàn)室間的比對19方法學(xué)的性能指標(biāo)

一

二

三第二節(jié)臨床生化檢驗(yàn)方法的性能評價(jià)

方法學(xué)性能評價(jià)的內(nèi)容

方法學(xué)評價(jià)試驗(yàn)

臨床生物化學(xué)方法學(xué)性能判斷

四20

可靠性

實(shí)用性

一方法學(xué)性能指標(biāo)準(zhǔn)確度精密度方便性經(jīng)濟(jì)性安全性

簡單快速可測范圍21

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`準(zhǔn)確度（accuracy）的傳統(tǒng)定義是指測定值與“真值”的接近程度。是指一次測定的結(jié)果與被測物真值的接近程度。

準(zhǔn)確度正確度

“正確度”（trueness），是指一系列測定結(jié)果得到的均值與“真值”的接近程度。通常以偏倚（bias）來表示精密度

精密度（precision）是指在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的檢測結(jié)果間的一致程度。不精密度（imprecision）通常用標(biāo)準(zhǔn)差（S）和變異系數(shù)（CV%）來表示22表21-3臨床生化檢驗(yàn)方法的誤差及評價(jià)方法系統(tǒng)誤差誤差分類評價(jià)試驗(yàn)評價(jià)指標(biāo)理想結(jié)果比例系統(tǒng)誤差回收試驗(yàn)回收率95-105%恒定系統(tǒng)誤差干擾試驗(yàn)干擾值接近0比例系統(tǒng)誤差方法對比試驗(yàn)Y=a+bXb接近1.0恒定系統(tǒng)誤差a接近0隨機(jī)誤差重復(fù)性試驗(yàn)（批內(nèi)、批間、日間）、總不精密度CV<3%二方法學(xué)性能評價(jià)內(nèi)容23回收試驗(yàn)

干擾試驗(yàn)

線性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)對比試驗(yàn)檢測限與檢測范圍批內(nèi)批間

日內(nèi)日間總不精密度三方法學(xué)評價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度24（一）重復(fù)性試驗(yàn)1.試驗(yàn)樣品一般選擇2個(gè)，一個(gè)在參考區(qū)間附近，另一個(gè)為異常值2.初步的批內(nèi)精密度評價(jià)：即一個(gè)樣品重復(fù)測定20次，計(jì)算出均值，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

用2個(gè)樣品每天測定2批，批間測定間隔不得少于2h，每批平行測定2份，至少共測定20天，80個(gè)數(shù)據(jù)。每對結(jié)果間的差（共40個(gè)）代表批內(nèi)差；2批均值之間的差（共20個(gè)）代表批間差；每天4個(gè)結(jié)果的均值（共20個(gè)）代表日間差。每批測定至少做一個(gè)質(zhì)控。

25（二）回收試驗(yàn)所謂回收即評定方法正確測定加入常規(guī)樣品中的純分析物的能力。即在未知濃度的常規(guī)樣品中加入一定量的待測組分，檢測加入前后該組分的增加量，實(shí)際增加量與理論加入量的比值就是回收率。目的是測定比例系統(tǒng)誤差。

26（三）干擾試驗(yàn)干擾是指在測定某分析物時(shí)，受其他非分析物的影響而導(dǎo)致測定結(jié)果增高（正干擾）或降低（負(fù)干擾）。根據(jù)干擾的產(chǎn)生原因分為：基質(zhì)效應(yīng)、非特異反應(yīng)、外部干擾物等。干擾試驗(yàn)的設(shè)計(jì)同回收試驗(yàn)，即將不同濃度的干擾物代替純標(biāo)準(zhǔn)品。一般規(guī)定只對膽紅素、血紅蛋白、脂類做干擾試驗(yàn)。干擾值＝加入干擾物后的測定值－基礎(chǔ)測定值

27（四）線性試驗(yàn)線性試驗(yàn)用來評價(jià)劑量和反應(yīng)之間的線性關(guān)系，并把呈直線部分確定為線性范圍（linearrange）。線性范圍指檢測信號與被測物濃度呈線性時(shí)的被測物濃度范圍。

1.樣品濃度線性評價(jià)至少應(yīng)有5個(gè)不同濃度，可選擇低值和高值樣品各一份，低值樣品和高值樣品分別按體積3：1混勻、等份混勻、1:3混勻，形成5個(gè)不同濃度。2..試驗(yàn)方法將不同濃度的樣品（X），隨機(jī)排列，每個(gè)樣品重復(fù)測定4次（Y），并要求在當(dāng)天完成所有分析。

28（五）對比試驗(yàn)對比試驗(yàn)是指分別用兩種方法測定一組臨床不同濃度和病理情況的樣品，測定結(jié)果進(jìn)行回歸分析。比較方法應(yīng)選擇參考方法或公認(rèn)的常規(guī)方法，測定偏差主要來源于評價(jià)方法。1.試驗(yàn)樣品應(yīng)收集新鮮的正常和異常的臨床樣品，應(yīng)有足夠?qū)挼臐舛确秶鳚舛葮悠窋?shù)量應(yīng)有合適的比例。2．樣品測定樣品數(shù)至少為40個(gè)，每個(gè)樣品用2種方法分別作雙份測定。每天測定8個(gè)樣品，雙份測定時(shí)第一次按順序1，2……7，8，第二次8，7……2，1，共測試5天。

29（六）檢測限檢測低限通常是指能與適當(dāng)?shù)摹翱瞻住弊x數(shù)相區(qū)別的待測物的最小量。方法是做空白平行試驗(yàn)（一般20次），以蒸餾水調(diào)零，讀取各次吸光度，計(jì)算均值（Ab）和標(biāo)準(zhǔn)差(S)。以Ab+3S表示與“空白”讀數(shù)相區(qū)別的最小吸光度，將其換算成濃度，作為該法的檢測低限。

臨床實(shí)驗(yàn)室以生物檢測限更為重要，需采用接近檢測低限的生物檢測限樣品來確定，能更真實(shí)地反映實(shí)際檢測限水平樣品測定的不確定度。

30系統(tǒng)誤差誤差分類評價(jià)試驗(yàn)評價(jià)指標(biāo)理想結(jié)果比例系統(tǒng)誤差回收試驗(yàn)Ea<1/2TEa恒定系統(tǒng)誤差干擾試驗(yàn)干擾值<1/2TEa比例系統(tǒng)誤差方法對比試驗(yàn)Y=a+bXXc-Yc<±1/2TEa隨機(jī)誤差重復(fù)性試驗(yàn)（批內(nèi)、批間、日間）、總不精密度總隨機(jī)誤差<1/3TEa四方法學(xué)性能判斷31臨床生化試劑盒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

一

二

三第三節(jié)臨床生化檢驗(yàn)試劑盒的性能評價(jià)

臨床生化檢驗(yàn)試劑盒的分類

臨床生化試劑盒的性能指標(biāo)及評價(jià)

臨床生化試劑盒的發(fā)展趨勢

四32體外診斷試劑體外診斷試劑（invitrodiagnosisregengts）用于完成一個(gè)特定體外診斷檢驗(yàn)，而包裝在一起的一組組分。試劑盒組分可包括抗體、酶、緩沖液、稀釋液、校準(zhǔn)物、控制物或其它物品和材料。

醫(yī)療器械是指：單獨(dú)或者組合使用于人體的儀器、設(shè)備、器具、材料或者其他物品。其使用目的是：疾病的預(yù)防、診斷、治療、監(jiān)護(hù)。33

一臨床生化試劑盒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《臨床化學(xué)體外診斷試劑（盒）通用技術(shù)要求》2006《臨床化學(xué)體外診斷試劑(盒)產(chǎn)品技術(shù)審評規(guī)范》201134

單液體型

液體雙試劑

二臨床生化試劑盒的分類單液體型特別適用于半自動生化分析儀和小型自動生化分析儀。穩(wěn)定性較差1.穩(wěn)定性能好2.可消除樣品自身空白3.提高抗干擾能力4．預(yù)反應(yīng)多項(xiàng)同測組合試劑濃縮試劑

351.試劑空白吸光度

2.試劑空白變化速率

3.分析靈敏度4.線性范圍5.重復(fù)性7.穩(wěn)定性

8.臨床試驗(yàn)

三試劑盒性能指標(biāo)和評價(jià)試劑盒6.準(zhǔn)確度36（一）試劑空白吸光度用蒸餾水做空白，用指定的空白液加入試劑作為樣品測試，在測試主波長下，記錄測試啟動時(shí)的吸光度（A1）和約5分鐘后的吸光度（A2），A2測試結(jié)果即為試劑空白吸光度測定值。是判定試劑質(zhì)量的一個(gè)有效指標(biāo)1.雙縮脲法測定總蛋白2.BCG法測定清蛋白3.改良賴氏法測定ALT4.NADH底物5.色素原底物

37（二）試劑空白變化速率對于速率法試劑盒，用指定的空白液加入試劑作為樣品測試時(shí)，在測試主波長下，記錄測試啟動時(shí)的吸光度（A1）和約5分鐘(T)后的吸光度（A2），計(jì)算試劑空白吸光度變化率（A/min）。測定試劑空白吸光度變化（ΔA/min），用來檢查試劑在工作狀態(tài)下的穩(wěn)定性。但事實(shí)上，試劑空白吸光度變化速率無法反映試劑盒的穩(wěn)定性，試劑空白吸光度變化速率主要反映干擾程度和儀器的穩(wěn)定性。

38（三）分析靈敏度用吸光度差值（ΔA）或吸光度變化（ΔA/min）來表示單位濃度的被測物反應(yīng)所引起的信號變化，其含義類似摩爾消光系數(shù)。

分析靈敏度不是越高越好，以適合待測物檢測范圍為原則。分析靈敏度一般用于批間比較，較能反映制造商的配方、原料的一致性。

39（四）線性范圍取高濃度樣品和低濃度樣品按不同比例混合成5個(gè)濃度做線性試驗(yàn)。

試劑（盒）的線性范圍越寬，臨床復(fù)測幾率越小，但與樣品/試劑比例成反比

40（五）重復(fù)性1.批內(nèi)重復(fù)性在重復(fù)性條件下，用高、中、低三個(gè)水平濃度（高、低濃度應(yīng)超過參考區(qū)間20%～30%，中濃度水平在參考區(qū)間之內(nèi)）的控制血清或新鮮人血清測試試劑，重復(fù)測試至少10次。2.批間重復(fù)性用質(zhì)量控制血清測試3×3（3個(gè)批號，每個(gè)批號取3瓶）批間差，較能反映制造商的配方、原料的一致性。干粉或凍干試劑還需測定批內(nèi)瓶間差，測定同一批號的試劑20瓶，用變異系數(shù)（CV）來表示。

41（六）準(zhǔn)確度1.相對偏差直接用試劑盒測定參考物質(zhì)（平行3次），評價(jià)測定均值與靶值的偏離程度。也可用由參考方法定值的高、中、低三個(gè)濃度的人混合血清，用試劑盒平行測定3次，計(jì)算均值與定值的相對偏差。

2.比對試驗(yàn)既無參考物質(zhì)、參考血清，也無標(biāo)準(zhǔn)品，