第十一講蛋白質(zhì)的測(cè)定

6.蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定6.1概述6.2凱氏定氮法6.3氨基酸氮的測(cè)定教學(xué)內(nèi)容了解蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)系數(shù)、氨基酸和氨基酸態(tài)氮的概念，凱氏定氮法原理和方法，氨基酸和氨基酸態(tài)氮的測(cè)定原理；掌握凱氏定氮法和雙指示劑甲醛滴定法、電位滴定法。自學(xué)引導(dǎo)題1、蛋白質(zhì)系數(shù)是如何計(jì)算出來(lái)的？2、蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有哪些？國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)是哪一種方法？6.1概述(1)蛋白質(zhì)的生理功能(2)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定意義(3)蛋白質(zhì)的組成及性質(zhì)(4)蛋白質(zhì)的測(cè)定方法(5)蛋白質(zhì)系數(shù)2004/4安徽阜陽(yáng)劣質(zhì)奶粉致大頭娃娃171,13人死頭臉胖大，四肢細(xì)短，體重比出生時(shí)還輕205個(gè)奶粉品46個(gè)不合格生產(chǎn)廠家的55種奶粉。分布8個(gè)省，其中蛋白質(zhì)含量低于5%的有31種，最少的僅為0.37%，（1）蛋白質(zhì)的生理功能蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)維持人體的酸堿平衡、水平衡遺傳信息的傳遞物質(zhì)的代謝及運(yùn)轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。

6.1概述

(2)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定意義人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),食品的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。合理開(kāi)發(fā)利用食品資源、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過(guò)程控制、提高和監(jiān)督產(chǎn)品質(zhì)量。蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，分子量很大。組成：20種氨基酸通過(guò)酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來(lái)化學(xué)元素：C、H、O、N（P、S、Cu、Fe、I）；官能基團(tuán)：肽鍵、氨基酸殘基、酸堿基因、芳香基團(tuán)結(jié)論：含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。(3)蛋白質(zhì)的組成及性質(zhì)

可分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，如含氮、肽鍵、折射率等；另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性或堿性基團(tuán)以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。目前蛋白質(zhì)測(cè)定最常用的方法是凱氏定氮法，通過(guò)測(cè)總氮量來(lái)確定蛋白質(zhì)含量。(4)蛋白質(zhì)的測(cè)定方法

蛋白質(zhì)系數(shù)：每份氮素相當(dāng)于的蛋白質(zhì)的份數(shù)。一般蛋白質(zhì)含氮為16%，所以1份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)。此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)，用F表示。不同的蛋白質(zhì)由于氨基酸的構(gòu)成比例及方式不同，含氮量不同。不同種類的食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同。(5)蛋白質(zhì)系數(shù)不同產(chǎn)品的蛋白質(zhì)系數(shù)(F)

玉米、雞蛋、青豆等：6.25

花生：5.46

大米：5.95

大豆及制品：5.71

小麥：5.70

牛乳及制品：6.38(1)

原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。從消耗的標(biāo)準(zhǔn)酸計(jì)算出總氮量，再折算為粗蛋白含量。常量凱氏定氮法

1、通過(guò)學(xué)習(xí)覬氏定氮法的原理，我們可知道操作分為哪幾個(gè)大的步驟？2、加入硫酸鉀、硫酸銅的作用是什么？自學(xué)引導(dǎo)

1、消化

反應(yīng)方程式如下：

2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O

濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。

濃硫酸又具有氧化性，將有機(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫：

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應(yīng)方程式如下：

2、蒸餾

2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3＋Na2SO4＋2H2O3、吸收

加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收：2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O4、滴定

待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3

準(zhǔn)確稱取均勻的固體樣品0.5～3g,或半固體樣品2～5g,或吸取溶液樣品15～25ml。小心移入干燥的凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸銅、10g硫酸鉀及25ml濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口置一小漏斗，瓶頸45°角傾斜置電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化。(2)測(cè)定方法①

樣品消化若無(wú)通風(fēng)櫥可于瓶口倒插入一口徑適宜的干燥管，用膠管與水力真空管相連接，利用水力抽除消化過(guò)程所產(chǎn)生的煙氣。先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈藍(lán)綠色。取下漏斗，繼續(xù)加熱0.5h，冷卻至室溫。注意問(wèn)題：①加入樣品不要沾附在凱氏燒瓶瓶頸；②消化開(kāi)始時(shí)不要用強(qiáng)火，要控制好熱源，并注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化完全；③樣品中若含脂肪或糖較多，在消化前應(yīng)加入少量辛醇或液體石蠟或硅油作消泡劑，以防消化過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫；④消化完全后要冷至室溫才能稀釋或定容。所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。②蒸餾、吸收按圖裝好蒸餾裝置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶?jī)?nèi)預(yù)先裝有50ml40g∕L硼酸溶液及混合指示劑5~6滴）。注意問(wèn)題：安裝的裝置應(yīng)整齊美觀、協(xié)調(diào)，儀器各部件應(yīng)在同一平面內(nèi)平行或垂直。不能漏氣。要注意控制熱源使蒸汽產(chǎn)生穩(wěn)定，不能時(shí)猛時(shí)弱，以免吸收液倒吸；蒸餾前加堿量應(yīng)使消化液呈深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀。冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾。3、滴定將接受瓶?jī)?nèi)的硼酸液用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑空白（除不加樣品，從消化開(kāi)始操作完全相同）。

注意問(wèn)題：所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。（3）試劑消化用：①濃硫酸②硫酸鉀③硫酸銅蒸餾用：④40%氫氧化鈉溶液吸收用：⑤4%硼酸滴定用：⑥0.1000mol/LHCl標(biāo)準(zhǔn)溶液⑦0.1%甲基紅乙醇溶液與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液混合指示劑硫酸鉀的作用

加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度其反應(yīng)式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過(guò)高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O硫酸銅的作用

催化作用、指示作用（消化完全指示：藍(lán)綠色；蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)完全指示：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀）

說(shuō)明事項(xiàng)：

蒸餾過(guò)程應(yīng)注意接頭處無(wú)松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開(kāi)液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開(kāi)，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。微量凱氏定氮法微量凱氏定氮法的原理與操作方法，與常量法基本相同，所不同的是樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套適于微量測(cè)定的定型儀器——微量凱氏定氮器。6.3氨基酸態(tài)氮的測(cè)定為提高蛋白質(zhì)的生理效價(jià)而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的理論，對(duì)食品加工工藝的改革，對(duì)保健食品的開(kāi)發(fā)及合理配膳等工作都具有積極的指導(dǎo)作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。

氨基酸的含量一直是某些發(fā)酵產(chǎn)品如調(diào)味品的質(zhì)量指標(biāo)，也是目前許多保健食品的質(zhì)量指標(biāo)之一，其中的含氮量可直接測(cè)定，不同于蛋白質(zhì)的氮，故稱為氨基酸態(tài)氮。氨基酸態(tài)氮反映的是樣品中游離氨基酸的總量。氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法6.4.1雙指示劑甲醛滴定法(1)原理氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而破壞內(nèi)鹽。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定-COOH基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。（2）操作：用中性紅作指示劑，先測(cè)定其它游離酸的含量再用百里酚酞作指示劑測(cè)定氨基酸和游離酸的總含量。（3）方法適用范圍淺色樣品(4)操作方法

移取含氨基酸約20～30mg的樣品溶液2份，分別置于250ml錐形瓶中，各加50ml蒸餾水，其中1份加入3滴中性紅指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅色變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)；另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，用0.1ml/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)。分別紀(jì)錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。式中

c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1——用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;V2——用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;m——測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol

(5)結(jié)果計(jì)算

氨基酸態(tài)氮

（%）6.4.2電位滴定法(1)原理根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的電極插入被測(cè)液中，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。(2)儀器酸度計(jì)（附磁力攪攔器）；(3)試驗(yàn)步驟①樣品處理吸取樣品液于100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL燒杯中,加水60mL，放入磁力轉(zhuǎn)子，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器使轉(zhuǎn)速適當(dāng)。用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正好酸度計(jì)，然后將電極清洗干凈，再插入到上述樣品液中，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2,記下消耗的NaOH溶液體積。②氨基酸的滴定在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,記下消耗的NaOH溶液體積。③空白滴定吸取80mL蒸餾水于250mL的燒杯中，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,記下加入甲醛后消耗的NaOH溶液體積。操作說(shuō)明：第一次滴定是除去其它游離酸，所消耗的NaOH溶液體積不用于計(jì)算。第二步滴定才是測(cè)定氨基酸，用消耗的NaOH溶液體積進(jìn)行計(jì)算。

（V1-V2）×C×0.014氨基酸態(tài)氮%=————————————×100m×20/100V1---醬油稀釋液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積mLV2---空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積mLC---NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度mol/Lm---吸取的醬油的質(zhì)量g0.014---氮的毫摩爾質(zhì)量g/mmol（4）結(jié)果計(jì)算作業(yè)現(xiàn)抽取南寧醬油廠生產(chǎn)的塑料袋裝鐵鳥(niǎo)牌醬油1袋（規(guī)格500mL）（生產(chǎn)日期20050520），要求測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量。某檢驗(yàn)員按密度瓶法測(cè)定了該醬油的相對(duì)密度為1.128，然后吸取醬油5.00mL于100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL燒杯中,加水60mL，放入磁力轉(zhuǎn)子，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器使轉(zhuǎn)速適當(dāng)。用pH6.18的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正好酸度計(jì)，然后將電極清洗干凈，再插入到上述醬油液中，用0.0498mol/L

NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2,消耗的NaOH溶液體積為2.21mL。在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,消耗的NaOH溶液體積為9.12mL。吸取80mL蒸餾水于250mL的燒杯中，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,加入甲醛后消耗的NaOH溶液體積為1.36mL。

1、請(qǐng)問(wèn)在測(cè)定過(guò)程中為什么要加入中性甲醛？

2、計(jì)算該次氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定結(jié)果。

3、該檢驗(yàn)員按同樣的方法另作了4次測(cè)定，結(jié)果分別為0.49%,0.36%,0.50%,0.52%，請(qǐng)你寫一份完整的檢驗(yàn)評(píng)價(jià)報(bào)告。相關(guān)知識(shí)點(diǎn)回顧：一、可疑值的取舍

Q檢驗(yàn)法：當(dāng)測(cè)定次數(shù)較少時(shí),Q檢驗(yàn)法是一種常用的簡(jiǎn)便方法。該法是將測(cè)定值按大小順序排列,由可疑值與其相鄰值之差的絕對(duì)值除以極差,求得Q值。

Q值愈大,表明可疑值離群愈遠(yuǎn),當(dāng)Q值超過(guò)一定界限時(shí)應(yīng)舍去可疑值。下表為不同置信度時(shí)的Q值。當(dāng)計(jì)算值大于或等于表中值時(shí),該可疑值應(yīng)舍去,否則應(yīng)予保留。

例如,平行測(cè)定鹽酸濃度(mol/L),結(jié)果為0.1014,0.1021,0.1016,0.1013。試問(wèn)0.1021在置信度為90%時(shí)是否應(yīng)舍去。

查表,當(dāng)n=4,Q0.90=0.76。因Q<Q0.90,故0.1021不能舍去。當(dāng)測(cè)定次數(shù)在3-10次之間時(shí)，最好用Q檢驗(yàn)法。二、對(duì)方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求，一般主要取決于被測(cè)對(duì)象的含量，含量越高要求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差越低，例如，大于10%的含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差一般不大于1%，隨著含量的降低，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可逐步增加，5%，10%，20%，30%甚至50%。生產(chǎn)工藝有特殊要求的，由技術(shù)條件決定。

習(xí)題講解：解：1、加入中性甲醛是為了固定氨基酸中的氨基，使羧基顯示出酸性，才能進(jìn)行氨基酸測(cè)定。2、依據(jù)題意，醬油的相對(duì)密度d420=1.128,取樣體積V＝5.00mL醬油的質(zhì)量m＝d420×V＝1.128×5.00＝5.64g醬油稀釋液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V1＝9.12mL空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V2＝1.36mLNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C＝0.0498mol/L根據(jù)電位滴定法，計(jì)算氨基酸態(tài)氮含量：（V1-V2）×C×0.014氨基酸態(tài)氮%=————————————×100

m×20/100（9.12-1.36）×0.0498×0.014＝――――――――――――――

×100

5.64×20/100＝0.483、先進(jìn)行數(shù)據(jù)處理從大到小排列測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)：0.36%，0.48%，0.49%,,0.50%,0.52%

可以看出0.36%與其它各次結(jié)果偏離太遠(yuǎn)，應(yīng)為測(cè)定可疑值。

X2