法醫(yī)DNA分型課件

法醫(yī)DNA分型STR遺傳標(biāo)記

DNA分型技術(shù)生物學(xué)、方法學(xué)和遺傳學(xué)的概況

生物學(xué)方法學(xué)遺傳學(xué)DNA提取DNA定量分析多STR遺傳標(biāo)記的PCR擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物的分離和檢測(cè)（STR等位基因）樣本基因型的判讀樣本基因型與其他樣本分型結(jié)果的比對(duì)以隨機(jī)匹配概率出具案件鑒定報(bào)告如果匹配，DNA紋印與群體數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算比較

生物學(xué)DNA的提?。涸诜治鯠NA前，必須將DNA同其他細(xì)胞物質(zhì)分離，細(xì)胞中包裹、保護(hù)DNA的細(xì)胞蛋白可抑制DNA分析。

DNA定量分析：是為了確保提取的DNA是來(lái)自人類而不是細(xì)菌之類的其他來(lái)源。PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：是一種酶促反應(yīng)，特定的DNA區(qū)域反復(fù)復(fù)制，產(chǎn)出大量特定的拷貝。DNA分型重復(fù)DNA:中等長(zhǎng)度的核心重復(fù)單位，有時(shí)稱為小衛(wèi)星或可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)（VNTR）.STR:長(zhǎng)度范圍大約在10-100各堿基；包括2-6個(gè)堿基重復(fù)單位的DNA區(qū)域稱為微衛(wèi)星、簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）或者（STR）.可分為兩類：VNTR分型、STR分型RFLP:用限制性內(nèi)切酶切割VNTR附近的DNA片段,稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)處理微量和低量法醫(yī)樣本的能力強(qiáng)于RFLP技術(shù)

法醫(yī)DNA分型使用的是STR分型STR分型的優(yōu)勢(shì)：可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化并使用靈敏的熒光檢測(cè)技術(shù)，法庭科學(xué)家可快速地從這些遺傳標(biāo)記中收集到的數(shù)據(jù)。同過(guò)對(duì)多個(gè)染色體上的基因座進(jìn)行分析，STR在無(wú)關(guān)個(gè)體甚至近親個(gè)體中都具有很高的分辨率。方法學(xué)：STR分型的流程圖數(shù)據(jù)收集確定峰顏色分離標(biāo)記峰與ladder相比較Genetype讀取等位基因分析者/檢驗(yàn)者瀏覽數(shù)據(jù)由第二分析者/檢驗(yàn)者確定結(jié)果GeneScanorFMBIOAnalysis

軟件GenetyperofStaRCallGeneMapperID軟件GeneMakerHID操作

一：輸入數(shù)據(jù)：選擇數(shù)據(jù)對(duì)話框（OpenDataFiles）二：運(yùn)行RunTemplateSelection包括：panel、內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)的顏色（默認(rèn)橙色）panel位置是理論上給出的每個(gè)基因座下面可能出現(xiàn)的所有等位基因的準(zhǔn)確（以后提到的Bin）內(nèi)標(biāo)（SizeStandard）:（試劑）用來(lái)轉(zhuǎn)化從時(shí)間到堿基長(zhǎng)度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)處理參數(shù)分為：原始數(shù)據(jù)處理（RawDataAnalysis）、SizeCall、AlleleCall三部分原始數(shù)據(jù)處理：（1）確定分析范圍；Auto-Range（2）使峰形圖更加的光滑smooth（3)起點(diǎn)統(tǒng)一到原點(diǎn)Baselinesubstraction（4）pull-upCorrection將連帶的峰刪除(5）SpikeRemoval去掉毛刺

Matrix文件：（ABI3100中稱為光譜校準(zhǔn)）為電泳時(shí)不同顏色的分離標(biāo)準(zhǔn)。該文件通過(guò)包含每種顏色的樣本的電泳而建立的。各種顏色的電泳結(jié)果組合成一種數(shù)學(xué)矩陣，以消除與其他顏色光譜重疊的部分。Matrix文件可為檢測(cè)設(shè)備提供熒光類型識(shí)別，對(duì)于檢測(cè)數(shù)據(jù)分析至關(guān)重要。Matrix失效稱為“Pull-up”,是由于檢測(cè)儀器無(wú)法正常識(shí)別標(biāo)記STR擴(kuò)增產(chǎn)物的染料顏色。這種現(xiàn)象是由于光譜的疊加造成的。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果超過(guò)設(shè)備的線性范圍時(shí)，峰就會(huì)出現(xiàn)其余顏色的“拔起”或者“滲透”。此時(shí)需要重新作”Matrix”的標(biāo)準(zhǔn)，軟件生成新的Matrix,即可糾正這一問(wèn)題。Sizecall：主要是進(jìn)行由時(shí)間到堿基長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)化Allelecall:(1)選擇分析范圍(2)設(shè)置峰的強(qiáng)度范圍(50-30000)下一個(gè)對(duì)話框：自動(dòng)校正Panel，自動(dòng)挑選最適合的Ladder選擇陽(yáng)性對(duì)照

AllelePeak分?jǐn)?shù)閾值混合樣本判斷閾值名詞解釋：1：Ladder:等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物（Allelicladders）是一個(gè)人為樣本。某一STR遺傳標(biāo)記在人群中常見(jiàn)的等位基因的混合物。是檢測(cè)每一個(gè)STR基因座的標(biāo)準(zhǔn)，它是對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室因儀器和條件不同檢測(cè)到的不同片段進(jìn)行校正的表要保證.含有特定STR遺傳標(biāo)記的所有等位基因。2：陰性對(duì)照：包含全部PCR混合物而不含有模板DNA，使用水或者緩沖液充當(dāng)模板成分，用于評(píng)估PCR成分是否被DNA污染。3：陽(yáng)性對(duì)照：用于監(jiān)控反應(yīng)成分是否失效或缺失。陽(yáng)性對(duì)照是一個(gè)已知序列的高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)DNA。與其他參與擴(kuò)增的樣本使用相同引物同時(shí)擴(kuò)增。目的是確認(rèn)反應(yīng)成分和溫度循環(huán)參數(shù)適宜擴(kuò)增特定DNA區(qū)域。4；混合樣本：Ladder當(dāng)中列出了，一個(gè)樣本基因座下可能出現(xiàn)的所有等位基因，即STR重復(fù)次數(shù)。但是一個(gè)樣本下，一個(gè)基因座下面只可能出現(xiàn)一到二個(gè)峰，出現(xiàn)三個(gè)或者三個(gè)以上的即認(rèn)為為混合樣本。檢查與修正SizeCall： 一般來(lái)說(shuō)，需要檢查分值80以下的樣本：通過(guò)增加或者減少峰來(lái)完成，主要實(shí)現(xiàn)，由時(shí)間轉(zhuǎn)化成長(zhǎng)度之間的線性關(guān)系。檢查ladder，PanelEditor里面校正ladder陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照：AllColorBrowser

峰圖：其中峰頂右邊顯示的小數(shù)表示的是雜合不平衡的比例。（兩個(gè)峰圖高度的比值，最好采用面積的比值）后面還有標(biāo)注的3X是指的放大的比例。正常的等位基因其名稱為綠框灰底；對(duì)于普通樣本，可疑的等位基因是黃底，失敗的等位基因是紅底。編輯等位基因輸出CODIS報(bào)告CODIS：

DNA聯(lián)合索引系統(tǒng)CombinedDNAIndexSystem是基于人類基因中13個(gè)地點(diǎn)連續(xù)DNA標(biāo)記和人類基因譜。它被經(jīng)常用于犯罪活動(dòng)是罪惡的還是清白的。聯(lián)合檢測(cè)13個(gè)CODIS核心基因座，無(wú)關(guān)個(gè)體的平均隨機(jī)匹配率大于萬(wàn)億分之一。

GenemarkerHID分析了16個(gè)基因座信息，其中包括已經(jīng)規(guī)定的13個(gè)基因座，還包括一個(gè)性別基因座，兩個(gè)額外的基因座。將報(bào)告提交給實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)，即LIMS（LaboratoryInformationManagementSystem）熒光定量信息：典型的單一樣本與混合樣本的STR分型存在差異。雜合子樣本STR分型圖譜通常會(huì)出現(xiàn)“Stutter”峰，其峰高或峰面積小于相應(yīng)峰的15%。另外，單一個(gè)體的分型圖譜中，也就是較低峰的相對(duì)熒光單位（RFU）除以較高峰的（RFU）得到的數(shù)值，應(yīng)該大于70%。因此，如果在某一STR基因座與最高峰的峰高比值在15%到70%之間時(shí)，提示樣本可能是來(lái)自兩個(gè)或多個(gè)個(gè)體的混合樣本。“Stutter”峰:仔細(xì)觀察STR電泳圖譜，通常會(huì)發(fā)現(xiàn)一些比每個(gè)等位基金峰少幾個(gè)堿基的小峰，這些Stutter產(chǎn)物是在用DNA聚合酶對(duì)STR基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過(guò)程中產(chǎn)生的。Stutter產(chǎn)物又被稱作影子帶，或者DNA聚合酶滑脫產(chǎn)物?；旌蠘颖镜呐袆e：基因座下面出現(xiàn)等位基因的數(shù)目為3，42個(gè)個(gè)體的混合樣本基因座下面出現(xiàn)等位基因的數(shù)目為5，63個(gè)個(gè)體的混合樣本基因座下面出現(xiàn)等位基因的數(shù)目大于63個(gè)及3個(gè)以上個(gè)體的混合樣本GenemapperIDGenemapperID

它擁有GeneScan與Genetyper分析數(shù)據(jù)的能力。GeneScan軟件根據(jù)內(nèi)標(biāo)分析計(jì)算DNA片段的大?。▔A基值），然后利用Genotyper軟件將樣品和AllelicLadder比較，確定各位點(diǎn)分型的值。

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