酶工程-第4章-酶的固定化

第四章酶的固定化

2——專一性強(qiáng)

——催化效率高

——作用條件溫和等4.1.1固定化酶的定義酶催化的優(yōu)點(diǎn)：（1）酶的穩(wěn)定性較差

（2）酶的一次性使用

（3）產(chǎn)物的分離純化較困難酶催化的缺陷為什么要將酶固定化?4——如果能設(shè)計(jì)一種方法，將酶束縛于特殊

的相，使它與整體相（或整體流體）分

隔開，但仍能進(jìn)行底物和效應(yīng)物（激活

劑或抑制劑）的分子交換。

——這種固定化的酶既具有酶的催化特性，

又具有一般化學(xué)催化劑能回收、反復(fù)使

用等優(yōu)點(diǎn)，并且生產(chǎn)工藝可以連續(xù)化、

自動化。設(shè)想5進(jìn)展1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶固定化酶的研究從20世紀(jì)50年代開始1953年德國的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體，經(jīng)重氮法活化后，分別與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結(jié)合，而制成固定化酶。20世紀(jì)從60年代起，固定化酶的研究迅速發(fā)展1969年，日本的千畑一郎首次在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸，實(shí)現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革。6※

酶的固定化方法研究

※

固定化方法和載體開發(fā)

※

應(yīng)用研究現(xiàn)狀7

所謂固定化酶，是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。固定化酶的定義8“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme）

“固相酶”（solidphaseenzyme）9在1971年第一屆國際酶工程會議上，正式建議采用“固定化酶”（immobilizedenzyme）的名稱。

固定化酶正式定名10（l）極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；

（2）可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱

連續(xù)反應(yīng)；

（3）在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；

（4）酶反應(yīng)過程能夠加以嚴(yán)格控制；

（5）產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；

（6）較游離酶更適合于多酶反應(yīng)；

（7）可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；

（8）酶的使用效率提高，成本降低。固定化酶與游離酶相比，具有下列優(yōu)點(diǎn):11缺點(diǎn)：（l）固定化時(shí)，酶活力有損失；（2）增加了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大；（3）只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子

底物，對大分子不適宜；（4）與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)；（5）胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離程序。12——酶的固定化方法很多，但對任何酶都適用的方法是沒有的。4.1.2固定化酶的制備方法13

制備固定化酶要根據(jù)不同情況（不同酶、不同應(yīng)用目的和應(yīng)用環(huán)境）來選擇不同的方法，但是無論如何選擇，確定什么樣的方法，都要遵循幾個(gè)基本原則。

一種固定化酶制備人參抗癌有效成份的方法（發(fā)明專利）

/patentfm/pt89/888258_3A08C.htm

固定化酶的制備原則14——必須注意維持酶的催化活性及

專一性，保持酶原有的專一性、

高效催化能力和在常溫常壓下

能起催化反應(yīng)的特點(diǎn)。原則115——固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動化、

連續(xù)化。原則216——固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。原則317——酶與載體必須結(jié)合牢固，從而使

固定化酶能回收貯藏，利于反復(fù)

使用。原則418——固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，在制

備固定化酶時(shí)，所選載體不與廢物、

產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。原則519原則6——固定化酶應(yīng)易與產(chǎn)物分離。20原則7——固定化酶成本要低，應(yīng)為廉價(jià)的、

有利于推廣的產(chǎn)品，以便于工業(yè)

使用。21——充分考慮到固定化酶制備過程和

應(yīng)用中的安全因素。原則822酶的固定化方法通常按照結(jié)合的類型進(jìn)行分類固定化方法分類非化學(xué)結(jié)合法結(jié)晶法分散法物理吸附法離子結(jié)合法化學(xué)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型23

——1結(jié)晶法

——2分散法

——3物理吸附法

——4離子結(jié)合法（一）非化學(xué)結(jié)合法24

※就是使酶結(jié)晶從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法。

※對于晶體來說，結(jié)晶的蛋白質(zhì)既是

載體也是催化劑。

※可以提供非常高的酶濃度，這一點(diǎn)

對于活力較低的酶而言更具有優(yōu)越性。1結(jié)晶法(crystallization)25——在不斷的重復(fù)循環(huán)中，酶會有損耗，從而使得固定化酶濃度降低。結(jié)晶法的局限性26※通過酶分散于水不溶相中從而實(shí)現(xiàn)固定

化的方法。

※對于在水不溶的有機(jī)相中進(jìn)行的反應(yīng)，最

簡單的固定化方法是將干粉懸浮于溶劑

中，

并且可以通過過濾和離心的方法將

酶進(jìn)行分離和再利用。2分散法(dispersion）27

對于用在水不溶性溶劑中的固定化酶，有許多途徑可以提高它們的反應(yīng)速率。28①正確的體系和貯存狀態(tài)使酶粉末充分分散，將有助于提高活力。

——在干燥過程中，加入多種化合物有助于酶的分散，這些化合物也作為穩(wěn)定劑和保護(hù)劑發(fā)揮作用。29②通過與親脂化合物的共價(jià)連接能增加酶

在有機(jī)相中的溶解度

——可以通過將其包埋在膜體系中或通過多相

反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)酶的固定化。30——利用各種固體吸附載體將酶或含

酶菌體吸附在其表面上而實(shí)現(xiàn)酶

固定化的方法。3物理吸附法(physicaladsorption)31——無機(jī)載體有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂

白土、高嶺石、氧化鋁、硅膠、膨潤土、羥基

磷灰石、磷酸鈣、金屬氧化物等；

——天然高分子載體有淀粉、白蛋白等；

——大孔型合成樹脂、陶瓷等；

——具有疏水基的載體（丁基或已基--葡聚糖凝膠）

可以疏水性吸附酶，以及以單寧作為配基的纖

維素衍生物等載體。載體32優(yōu)點(diǎn)：具有酶活性中心不易被破壞、酶高級

結(jié)構(gòu)變化少、操作方便、條件溫和、

載體廉價(jià)易得、可反復(fù)使用等。

缺點(diǎn)：酶與載體相互作用力弱、酶易脫落等。33定義：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換

基的水不溶性載體的固定化方法。4離子結(jié)合法(ionadsorption)34——陰離子交換劑

如DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠，

AmberliteIRA-93，410，900等；

——陽離子交換劑

如CM-纖維素，AmberliteCG-50，

IRC-50，IR-120，Dowex-50等。載體35——操作簡單，

——處理?xiàng)l件溫和，

——酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸

殘基不易被破壞，

——能得到酶活回收率較高的固定化酶。離子結(jié)合法的優(yōu)點(diǎn)36——載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受

緩沖液種類或pH的影響，在離子強(qiáng)

度高的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，酶往往

會從載體上脫落。缺點(diǎn)37迄今已有許多酶用離子結(jié)合法固定化，例如1969年最早應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化氨基?；妇褪鞘褂枚嗵穷愱庪x子交換劑DEAE-葡聚糖凝膠固定化的。38DEAE-Sephadex固定化氨基?；福簩EAE-SephadexA25充分溶脹，用0.5mol/LNaOH和水洗滌后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙?！狣L-Ala活力為25umol/m1·h)充分混合(1g濕重載體加60ml酶液)后，于低溫下攪拌過夜后，吸去上清液，再用蒸餾水和0.15mol/L醋酸鈉水溶液洗滌固定化酶，置4℃?zhèn)溆谩９潭ɑ富盍厥?0-60％，水解乙?！狣L—A1a活力為600-800umol/g·h濕固定化酶。氨基?；敢部晒潭ㄓ贒EAE—纖維素。39固定化青霉素酰化酶的生產(chǎn)40

——1共價(jià)結(jié)合法

——2交聯(lián)法（二）化學(xué)結(jié)合法41原理是酶蛋白分子上的功能基團(tuán)和固相支持物表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，從而將酶固定在支持物上。

歸納起來有兩類:

——一是將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。

——另一種是在載體上接上一個(gè)雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去。1共價(jià)結(jié)合法(covalentbinding）42——或氨基、、或-羧基、巰基、

羥基、咪唑基、酚基等。

——參與共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基不應(yīng)是

酶催化活性所必需的，否則往往造

成固定后的酶活性完全喪失?？膳c載體共價(jià)結(jié)合的酶的功能團(tuán)43共價(jià)結(jié)合法與離子結(jié)合法或物理吸附法相比的優(yōu)點(diǎn)

——酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，利于

連續(xù)使用，一般不會因底物濃度高或

存在鹽類等原因而輕易脫落。44缺陷

——反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜；

——會引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)變化，破壞部分

活性中心。45——天然有機(jī)載體（如多糖、蛋白質(zhì)、細(xì)胞）

——無機(jī)物（玻璃、陶瓷等）

——合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龍等）所用載體分三類可使載體活化的方法已經(jīng)有很多，主要的有

——重氮法

——疊氮法

——溴化氰法

——烷化法47酶蛋白中的游離氨基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基等參與此反應(yīng)。

很多酶，尤其是酪氨酸含量較高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶、β-葡萄糖苷酶等能與多種重氮化載體連接，獲得活性較高的固定化酶。（1）重氮法48（2）疊氮法49（3）溴化氰法50溴化氰法51溴化氰法能在非常溫和條件下與酶蛋白的氨基發(fā)生反應(yīng)，它已成為近年來普遍使用的固定化方法，尤其是溴化氰活化的瓊脂糖已在實(shí)驗(yàn)室廣泛用于制備固定化酶以及親和層析的固定化吸附劑。52（4）烷基化法三氯-均-三嗪三氯-均-三嗪纖維素53（5）活化酯法54（6）環(huán)氧化法55（7）高碘酸法56

要求載體惰性，且有一定的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，同時(shí)具備在溫和條件下與酶結(jié)合的功能基團(tuán)；必須在溫和pH、中等離子強(qiáng)度和低溫的緩沖溶液中；所選擇的偶聯(lián)反應(yīng)對酶的其他功能基團(tuán)副作用盡可能少；盡量減少載體的空間位阻對酶活力的影響。共價(jià)結(jié)合法中的幾個(gè)影響因素57定義：是指借助于雙功能或多功能試劑能

使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，而利

用雙功能試劑或多功能試劑使酶與

酶之間交聯(lián)，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)固定化

酶的方法。2交聯(lián)法（cross-linking）58——N末端的-氨基

——賴氨酸的-氨基

——酪氨酸的酚基

——半胱氨酸的巰基

——組氨酸的咪唑基等參與交聯(lián)反應(yīng)的酶蛋白的功能團(tuán)——形成希夫堿的戊二醛，

——形成肽鍵的異氰酸酯，

——發(fā)生重氮偶合反應(yīng)的雙重氮聯(lián)苯胺或

N，N’-乙烯雙馬來亞胺等。

最常用的交聯(lián)劑是戊二醛。交聯(lián)劑/doc/70270/149550.html60戊二醛在蛋白質(zhì)化學(xué)方面的應(yīng)用由于戊二醛具有提高生物高分子材料的壽命和強(qiáng)度、消毒、滅菌、防腐以及消除抗原等特性，上世紀(jì)隨著生物高分子材料的開發(fā)，戊二醛的應(yīng)用研究得到了突破性進(jìn)展。戊二醛與蛋白質(zhì)交聯(lián)的特點(diǎn)是活性高、反應(yīng)快、結(jié)合量大、產(chǎn)物穩(wěn)定、對沸水、酸、酶的抵抗能力強(qiáng)。用戊二醛制備的許多種生物組織材料具有消除抗原、減小排異反應(yīng)和優(yōu)異的血相容等優(yōu)點(diǎn)，可用于人體臟器的修復(fù)。采用0.3%戊二醛溶液為交聯(lián)劑得到的固定化木瓜蛋白酶具有很高的活性回收率，廣泛用于啤酒和飲料澄清、肉類嫩化和復(fù)配消化藥物等方面，有利于提高這種酶的利用率和降低生產(chǎn)成本。以氨丙基多孔硅球作載體，用戊二醛作交聯(lián)劑制備的固定化嗜熱菌蛋白酶在水相中能較好的合成二肽甜味劑Aspartame前體，最高產(chǎn)率可達(dá)95%，并具有良好的重復(fù)使用性能。將膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和辣根過氧化物酶通過戊二醛交聯(lián)反應(yīng)，固定在牛血清蛋白上，可制成一種高靈敏度的膽固醇生物傳感器用的傳感膜。62——制備的固定化酶一般比較牢固，可以長

時(shí)間使用。

——固定化的酶活回收率一般較低。

——降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間有利于

固定化酶比活的提高。

特點(diǎn)63定義：將酶包埋在各種多孔載體中使酶固定化的方法。

——網(wǎng)格型

——微囊型

/medicine/pro/pharmacy/2006-12-31-313102.shtml（三）包埋法(entrapment)64——將酶或微生物包埋在高分子凝膠細(xì)微

網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型網(wǎng)格型（gel(lattic)entrapment）65——聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹脂等

合成高分子化合物

——淀粉、蒟蒻粉、明膠、膠原、海藻酸

和角叉菜膠等天然高分子化合物常用的載體材料66——將酶或微生物包埋在高分子半透膜

中的稱為微囊型。微囊型（microencapsulation）67制備微囊型固定化酶方法——界面沉淀法——界面聚合法——二級乳化法——脂質(zhì)體包埋法68——包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸

殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的高

級結(jié)構(gòu)，酶活回收率較高。

——但是在包埋時(shí)發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)，酶

容易失活，必須巧妙設(shè)計(jì)反應(yīng)條件。特點(diǎn)69——僅小分子可以通過高分子凝膠的網(wǎng)格擴(kuò)

散，且這種擴(kuò)散阻力會導(dǎo)致固定化酶動

力學(xué)行為的改變，降低酶活力。

——包埋法只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物

的酶，對于那些作用于大分子底物和產(chǎn)

物的酶是不適合的。70各種固定化酶方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較特性物理吸附法離子結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法包埋法制備易易難難易結(jié)合力中弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)酶活力高高中中高底物專一性無變化無變化有變化有變化無變化再生可能可能不可能不可能不可能固定化費(fèi)用低低中高中適用性酶源多較廣較廣小分子底物、藥用酶廣泛71

4.2輔酶的固定化1.輔酶的定義——約1/3的酶的催化反應(yīng)需要另一種非蛋白

質(zhì)性質(zhì)的小分子化合物，這些小分子物

質(zhì)統(tǒng)稱輔因子?！唵蔚慕饘匐x子，例如Mg2+，Mn2+等

無機(jī)輔因子。

——一種與酶蛋白或緊或松地聯(lián)結(jié)在一起的

有機(jī)物質(zhì)，即有機(jī)輔因子。

72其中有機(jī)輔因子有兩類

——輔酶

——輔基73——從某反應(yīng)向另一反應(yīng)傳遞物質(zhì)

——與酶蛋白結(jié)合得比較松散

——往往能夠通過透析法除去。輔酶（酶間載體）74——脫氫酶反應(yīng)中需要的輔酶I（NADH和

NAD+）和輔酶II（NADPH和NADP＋）

能傳遞電子；

——連接酶在催化生物合成反應(yīng)中所需要的

ATP能傳遞磷酸基，以及輔酶A（CoA）

能傳遞乙?；取?5——與酶蛋白結(jié)合相當(dāng)緊密，用透析法不

易除去，必須經(jīng)過一定的化學(xué)處理才

能使之分離。

——是酶活性中心的組成部分。輔基（酶內(nèi)傳遞）76——過氧化氫酶中的鐵卟啉，黃素酶類

中的黃素核苷酸（FMN和FAD）及

B6、B12等。77輔酶固定化的目的——有機(jī)輔因子的價(jià)格較昂貴，在工業(yè)上

應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留

和再生。78——輔基與酶蛋白的結(jié)合比較牢固，用超

濾膜截留等物理方法進(jìn)行回收。

——對于輔酶，直接用超濾膜截留并不理

想。將輔酶固定在可溶性的或不可溶

性的大分子載體上，這樣就便于回收

再生。79輔酶的固定化方法——輔基的固定化——輔酶的固定化

80——應(yīng)選擇合適的載體

——間隔臂（手臂）的選擇輔基的固定化81——沒有特異性吸附

——具有多孔性

——有適合引入配基的官能團(tuán)

——化學(xué)穩(wěn)定性

——具有適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度等。理想的載體應(yīng)具有以下的條件82——瓊脂糖

——纖維素

——玻璃珠

——合成高分子載體等。目前使用的載體83——需要0.5~1.0nm長的手臂

——考慮輔基的性質(zhì)間隔臂（手臂）的選擇84——在不影響輔基活性的分子部位引入適當(dāng)?shù)?/p>

功能團(tuán)。

——一般引入羧基或氨基后，與載體偶聯(lián)比較

容易。

——如果輔基分子本身具有不參與催化活性的

適當(dāng)?shù)墓δ軋F(tuán)時(shí)，就不必預(yù)先引入功能團(tuán)。85——一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以

及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)

行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后用在超濾器中。輔酶的固定化86輔酶NAD+在瓊脂糖上的固定化8788輔酶的高分子化⑴引入功能團(tuán)和間隔臂

——輔酶引入的功能團(tuán)主要是氨基或羧基。⑵高分子化具有羧基的輔酶衍生物可以用碳二亞胺的縮合反應(yīng)使其與具有氨基的聚賴氨酸、聚乙亞胺等水溶性高分子結(jié)合而高分子化。不預(yù)先引入功能團(tuán)，用一步反應(yīng)也能實(shí)現(xiàn)高分子化。在輔酶高分子化過程中水溶性高分子的選擇也很重要。首先其溶解度要大，分子大小要適當(dāng)，使其能保持在半透膜內(nèi)；分子過大會增加溶液黏度和影響輔酶活性。高分子化輔酶的活性與高分子大小、結(jié)構(gòu)、疏水性、親水性的程度，解離基的有無和種類，結(jié)合于高分子的輔酶量等有關(guān)。894.2.3輔酶的再生根據(jù)輔酶和酶的固定化情況，需要輔酶的酶反應(yīng)系統(tǒng)一般有如下幾種類型：

（1）輔酶和酶均不固定的反應(yīng)系統(tǒng)；

（2）輔酶不固定而酶固定的反應(yīng)系統(tǒng)；

（3）輔酶固定而酶不固定的反應(yīng)系統(tǒng)；

（4）輔酶和酶分別固定的反應(yīng)系統(tǒng)；

（5）輔酶和酶共固定的反應(yīng)系統(tǒng)；

（6）輔酶與酶分子偶聯(lián)形成輔酶-酶復(fù)合物的反應(yīng)

系統(tǒng)。90輔酶固定化的反應(yīng)系統(tǒng)91——一個(gè)酶的活性中心能與另一個(gè)酶的活性

中心相互定向，而輔酶與其中一個(gè)酶分

子相結(jié)合，它的手臂分子的長度又適于

輔酶分子與兩個(gè)酶的活性中心相互作用。

——輔酶能在兩個(gè)酶的活性中心之間進(jìn)行游

擺從而得到再生。最理想的構(gòu)型92固定化酶的性質(zhì)931固定化對酶活性及酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響

固定化后酶活性變化：

固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶小，其專一性也能發(fā)生改變。

4.3固定化酶催化反應(yīng)動力學(xué)94例如

用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，對高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30%，而對低分子底物苯酞精氨酸-對硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般認(rèn)為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。95在同一測定條件下，固定化酶的活力要低于等摩爾原酶的活力的原因可能是：

①酶分子在固定化過程中，空間構(gòu)象會有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸；

②固定化后，酶分子空間自由度受到限制(空間位阻)，會直接影響到活性中心對底物的定位作用；

③內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻；

④包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能過膜與酶接近。96值得注意的是

——有個(gè)別情況，酶在固定化后反

而比原酶活力提高。

——原因可能是偶聯(lián)過程中酶得到化

學(xué)修飾，或固定化過程提高了酶

的穩(wěn)定性。97酶的穩(wěn)定性包括

——熱穩(wěn)定性

——對各種有機(jī)試劑穩(wěn)定性

——對酶抑制劑的穩(wěn)定性

——對不同pH（酸度）穩(wěn)定性

——對蛋白酶穩(wěn)定性

——貯存穩(wěn)定性

——操作穩(wěn)定性2固定化對酶穩(wěn)定性的影響98Merlose曾選擇50種固定化酶，就其穩(wěn)定性與固定化前的酶進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其中有30種酶經(jīng)固定化后穩(wěn)定性提高，12種酶無變化，只有8種酶穩(wěn)定性降低。99熱穩(wěn)定性

固定化酶的穩(wěn)定性變化固定化酶；2.自然酶100——酶固定化后，對底物作用的最適pH和

pH-活性曲線常常發(fā)生偏移

——一般說來，用帶負(fù)電荷載體制備的固定

化酶，其最適pH和pH-活性曲線較游離

酶偏高；反之，使用帶正電荷的載體其

最適pH向酸性偏移固定化酶的最適pH變化101pH對固定化前后天冬酰胺酶活力的影響1.固定化酶；2.游離酶102——酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應(yīng)速度的綜合結(jié)果。由于固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是非常有利的結(jié)果。

——當(dāng)然，也有報(bào)道最適溫度不變或下降的。3固定化酶的最適溫度變化103

固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因，可能有以下幾點(diǎn)：

①固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，增加了

酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸

展變形。

②阻擋了不利因素對酶的侵襲。

③抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合后，

由于酶失去了分子間相互作用的機(jī)會，從

而抑制了自降解。1044影響固定化酶性能的因素——固定化酶制備物的性質(zhì)取決于所用的酶

及載體材料的性質(zhì)?！负洼d體之間相互作用使固定化酶具備

了化學(xué)、生物化學(xué)、機(jī)械及動力學(xué)方面

的性質(zhì)。

105成分參數(shù)酶生物化學(xué)性質(zhì)分子量，輔基，蛋白質(zhì)表面的功能基團(tuán)，純度（雜質(zhì)的失活或保護(hù)作用）動力學(xué)參數(shù)專一性，pH及溫度曲線，活性及抑制性的動力學(xué)參數(shù)，對pH，溫度，溶劑，去污劑及雜質(zhì)的穩(wěn)定性。載體化學(xué)特征化學(xué)組成，功能基，膨脹行為，基質(zhì)的可及體積，微孔大小及載體的化學(xué)穩(wěn)定性機(jī)械性質(zhì)顆粒直徑，單顆粒壓縮行為，流動抗性（固定床反應(yīng)器），沉降速率（流體床），對攪拌罐的磨損。固定化酶固定化方法所結(jié)合的蛋白，活性酶的產(chǎn)量，內(nèi)在的動力學(xué)參數(shù)（即無質(zhì)量轉(zhuǎn)移效應(yīng)的性質(zhì)）質(zhì)量轉(zhuǎn)移效應(yīng)分配效應(yīng)（催化劑顆粒內(nèi)外不同的溶質(zhì)濃度），外部或內(nèi)部（微孔）擴(kuò)散效應(yīng)；這些給出了游離酶在合適反應(yīng)條件下的效率。穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性(表示為工作條件下的活性降低)，貯藏穩(wěn)定性效能生產(chǎn)力（產(chǎn)品量/單位活性或酶量），酶的消耗（酶單位數(shù)/公斤產(chǎn)品）固定化酶的特征參數(shù)106固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—AlaAminoacylase氨基?；?969年日本利用固定化氨基酰酶，由乙?；?DL-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸獲得成功，是世界上固定化酶大規(guī)模應(yīng)用的首例。1974年以來，已能將米曲霉的氨基酰化酶固定在DEAE-Sephadex上生產(chǎn)出L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸等。工業(yè)成本降低約40％，產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等等。107世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，應(yīng)用最為成功的一種固定化酶。葡萄糖異構(gòu)酶108采用固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶生產(chǎn)高果糖漿，生產(chǎn)能力達(dá)到lkg固定化酶轉(zhuǎn)化成42型果葡萄漿7～8噸。用α-淀粉酶將玉米粉水解生成寡糖，再用葡萄糖淀粉酶處理產(chǎn)生95％~97％葡萄糖。由于葡萄糖的甜度比蔗糖低得多，所以利用葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖異構(gòu)化