分子生物學(xué)常用儀器介紹課件

研究生實(shí)驗(yàn)技能培訓(xùn)

－－分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用儀器介紹實(shí)驗(yàn)中心Biometra梯度PCR儀工作原理多次重復(fù)“變性解鏈—退火—合成延伸”的循環(huán)

Mullis開車的時(shí)候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA，……PCR儀的應(yīng)用領(lǐng)域基因、DNA片段的克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測定基因定點(diǎn)突變基因型（突變）檢測，SNP分析，遺傳背景分析生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究基因表達(dá)量研究（real-timePCR）/基因表達(dá)譜研究（DNAchip,SAGE）醫(yī)學(xué)領(lǐng)域疾病基因檢測/遺傳病的產(chǎn)前診斷致病病原體的檢測腫瘤治療中癌基因的檢測

會(huì)推廣到大部分疾病治療前的檢測

DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別、法醫(yī)物證其他:

動(dòng)、植物檢疫（轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物檢測）

PCR儀器的變遷三個(gè)水浴鍋，用手移動(dòng)（Mullis等人當(dāng)時(shí)用的）電加熱塊＋自來水冷卻（PE，1988）電加熱塊＋內(nèi)置循環(huán)液冷卻（PE，1989）三個(gè)加熱塊＋機(jī)械手（Stratagene，1994）半導(dǎo)體制冷和加熱（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）溫度梯度,熒光檢測(如Roche的Lightcycler)風(fēng)加熱Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國的狀況1991年出現(xiàn)三個(gè)水浴鍋+機(jī)械手的原始PCR儀（華美，復(fù)日等）現(xiàn)在以半導(dǎo)體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈,廈門安普利等）PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類：PCR擴(kuò)增儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀普通的PCR擴(kuò)增儀又衍生出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴(kuò)增功能的原位PCR儀等。1996年由ABI公司首先推出將擴(kuò)增和檢測融為一體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR儀，PCR儀的主要參數(shù)溫度控制要精確度升降溫的速度更快的升降溫速度，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時(shí)間，能提高PCR反應(yīng)特異性。ABI早就有升降溫速度高達(dá)5°Ceppendorf也推出了升降溫速度可達(dá)到6℃/秒和4.5/秒梯度PCR儀

“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng)條件。原位PCR擴(kuò)增

在PCR儀上增加原位PCR模塊就可以在玻片上進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增，多槽式高通量PCR儀

隨著基因組高通量研究的需求的提高M(jìn)J有一種一拖四，就是1個(gè)主機(jī)帶4個(gè)擴(kuò)增槽，每個(gè)槽可以獨(dú)立控溫，一次可以作96x4個(gè)樣品的PCR，不過一旦出現(xiàn)問題4個(gè)都不能用了。ABI則在原來的9700的基礎(chǔ)上推出了雙384孔的基座，一次完成384x2個(gè)樣品，使得9700的功能又?jǐn)U展到高通量領(lǐng)域而無需購買新的機(jī)器，可惜兩個(gè)384槽不能獨(dú)立控溫。eppendorf則有一個(gè)控制面板，可以控制5個(gè)獨(dú)立的PCR儀，每臺(tái)機(jī)器可以聯(lián)合，而且互不影響，但是比較浪費(fèi)空間。

樣品基座——PCR反應(yīng)多在0.2或者0.5的管子中進(jìn)行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。eppendorf有一個(gè)有趣的設(shè)計(jì)，一個(gè)槽內(nèi)帶有0.2和0.5兩種不同樣品孔，不需更換基座就可以分別使用兩種不同的反應(yīng)管ABI的9700就可以更換不同的樣品槽軟件——新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡易性。大屏幕，顯示實(shí)時(shí)信息，倒計(jì)時(shí)，記憶存儲(chǔ)多個(gè)程序、自動(dòng)斷電保護(hù)等都有助于實(shí)驗(yàn)室中的復(fù)雜環(huán)境使用。Biophotometer生物分光光度計(jì)Biophotometer

生物分光光度計(jì)使用常見問答

答：DNA的在Biophotometer上能測定的最高濃度并沒有一個(gè)絕對的值，這是因?yàn)檫@個(gè)濃度跟使用的比色皿光程和樣品的稀釋比例有關(guān)的。Biophotometer測定的最大吸光度是3.0。當(dāng)測定的DNA樣品吸光度大于2.5時(shí)，建議采用2mm的比色皿光程替代10mm。10mm光程下測定的A260=2.5時(shí)，相當(dāng)于125μg/ml濃度的雙鏈DNA，1.25μg/ml的1:10稀釋。如果是在2mm光程6.25μg/ml的1:10稀釋。答：Biophotometer在260nm下能夠測定的最小吸光度是0.05，這個(gè)吸光度值相當(dāng)于濃度為2.5μg/ml的雙鏈DNA的吸光度（約125ng雙鏈DNA溶解在50μl溶液中），請確保核酸樣品的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因?yàn)闃悠分械碾s質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會(huì)對光有一定吸收，其值<0.1。答：請檢查以下操作中的細(xì)節(jié)是否有所注意：1－DNA樣品的A260吸光度值是否>0.1。請注意，這個(gè)值跟儀器無關(guān)，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因?yàn)闃悠分械碾s質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會(huì)對光有一定吸收，其值<0.1）2－待測樣品是否經(jīng)過了充分的混勻，這樣才能保證測定值的均一3－待測樣品中有相當(dāng)含量的雜質(zhì)。A260/A280和260/A230是DNA純度的指示值，純度好的DNA，在pH7-8.5下其比值應(yīng)該在2.0或2.5，A230是多肽、芳香基團(tuán)、苯酚和一些碳?xì)浠衔锏奈舛?，A280是蛋白質(zhì)的吸光度答：產(chǎn)生四個(gè)加號(hào)的原因是因?yàn)闇y量的數(shù)值超過了測量上限>3.0A，請檢查1－比色皿是否被完全壓入比色皿槽內(nèi)，出現(xiàn)加號(hào)有可能是比色皿的基座擋住了光線的通路。2－您使用的比色皿的中心高度是否在8.5mm？3－比色皿中是否加入了足夠量的空白對照溶液？核酸與蛋白的電泳分析瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中可用于科研及檢測分析電泳槽水平平板垂直平板垂直電泳系統(tǒng)凝膠濃度選擇瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍電泳緩沖液

常用三種緩沖液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀TAE：緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而推薦選用TAE。緩沖液中的EDTA可螯合二價(jià)陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解核酸電泳的指示劑指示劑：溴酚蘭二甲苯青溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色二甲苯青：水溶液呈蘭色電泳時(shí)，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當(dāng)載樣緩沖液指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液作用：①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)②在電泳中形成肉眼可見的指

示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置③使樣品呈色，使加樣操作更方便核酸電泳的染色劑最常用的染色劑溴化乙錠銀染色蛋白電泳的染色劑最常用的染色劑考馬斯亮藍(lán)G考馬斯亮藍(lán)R溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收BIO-PROFIL凝膠成像分析系統(tǒng)主要用途瓊脂糖電泳，聚丙烯酰胺電泳，DNA、RNA和蛋白質(zhì)1D\2D電泳凝膠，SouthernNorthern和Western印跡膜；點(diǎn)雜交膜；薄層層析板、TCL放射自顯影膠片、菌落等樣品的圖像采集和分析，可對核酸、蛋白質(zhì)的凝膠電泳條帶進(jìn)行分子量大小及含量分析?；窘M成密閉型機(jī)箱：

一體化全封閉暗箱，設(shè)計(jì)精巧；最大程度上避免紫外線對人體的傷害。紫外透射臺(tái)：

紫外光源波長254/306/365nm，紫外透射面積20x25cm。白光板（可選）：

透射面積20x25cm

相機(jī)：

帶積分功能高清晰黑白攝像頭；高分辨率數(shù)碼相機(jī)；高分辨率專業(yè)數(shù)字黑白CCD攝像頭。

鏡頭：

電動(dòng)/自動(dòng)鏡頭。主要用途（1）圖像獲取圖像獲取容易可以以多種格式存儲(chǔ)獲取粘貼板上的圖像、與其它軟件交換圖像資源圖像復(fù)制功能，對所獲取的原始圖像進(jìn)行剪切、復(fù)制

主要用途（2）圖像處理彩色圖像轉(zhuǎn)換為黑白灰度圖像圖像的鏡像和旋轉(zhuǎn)圖像反色、即負(fù)片效果圖像的對比度／亮度調(diào)整圖像的均勻化、平整區(qū)域、背景校正圖像的銳化、柔化、羽化、強(qiáng)化物體邊緣主要用途（3）圖像分析條帶定位：提取圖象中的條帶信息，確定泳道中是否有條帶存在并定位分子量計(jì)算：在輸入Mark泳道中各條帶的已知分子量后，由計(jì)算機(jī)求出指定未知條帶的分子量和bp值（堿基對數(shù)）。密度掃描：對指定泳道進(jìn)行掃描，繪出掃描曲線，并計(jì)算出該泳道中各條帶的密度積分和峰高背景去除：多種去背景的方法，并可對掃描曲線進(jìn)行去背景后矯正離心機(jī)AvantiJ-301高速冷凍離心機(jī)主要附件：8*50ml角轉(zhuǎn)（Max30000rpm）10*100ml角轉(zhuǎn)（Max18000rpm）6*38.5ml水平轉(zhuǎn)頭（Max24000rpm）冷凍超速離心機(jī)主要附件：10*2ml角轉(zhuǎn)（Max130000rpm）8*8ml角轉(zhuǎn)（Max80000rpm）工作原理離心機(jī):利用慣性離心力分離液態(tài)非均相混合物的機(jī)械。根據(jù)分離方式可分為：過濾式分離式沉降式。若被處理的物料為懸浮液就稱為離心沉降；若被處理的物料為乳濁液稱為離心分離。

主要用途主要用于各種生物大分子的分離、純化、濃縮（如對病毒、生物大分子、高聚化合物沉降等）同時(shí)還可進(jìn)行相對分子量的測定等。轉(zhuǎn)子固定角轉(zhuǎn)子水平轉(zhuǎn)子離心力公式：G(xg)=11.18(rpm/1000)2xRR:radiusrpm:roundperminute離心機(jī)的分類分離因數(shù)KC：離心力與重力之比（即U2T/Rg）根據(jù)KC分為常速KC<3000（6000rpm)高速KC=3000~50000（25000rpm)超速KC>50000（90000rpm)離心機(jī)使用注意事項(xiàng)揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機(jī)腔或造成事故要等到轉(zhuǎn)速為零時(shí)才能打開離心機(jī)蓋,取出樣品。離心機(jī)的正確操作方法離心管的安放：平衡離心速度的設(shè)定離心力與離心率離心速度必需根據(jù)離心樣品的平均密度確定ForAngleRotorForSwingRotor使用后的維護(hù)與保養(yǎng)注意腔底的周邊清潔O圈的作用密閉真空，防止樣品飛濺生物安全防護(hù)，阻止有害生物樣品外泄增加蓋子與轉(zhuǎn)子體的阻尼，防止蓋子松脫ThermoForma

高溫滅菌二氧化碳培養(yǎng)箱

工作原理通過在培養(yǎng)箱箱體內(nèi)模擬形成一個(gè)類似細(xì)胞/組織在生物體內(nèi)的生長環(huán)境如：恒定的酸堿度（pH值：7.2-7.4）穩(wěn)定的溫度（37°C）較高的相對濕度（95%）穩(wěn)定的CO2水平（5%）來對細(xì)胞/組織進(jìn)行體外培養(yǎng)的一種裝置。

二氧化碳培養(yǎng)箱的基本的要求一是能夠?qū)囟?、二氧化碳濃度和濕度提供最精確穩(wěn)定的控制二是能夠?qū)ε囵B(yǎng)箱內(nèi)的微生物污染進(jìn)行有效的防范，并且能夠定期消除污染溫控系統(tǒng)溫度控制

根據(jù)加熱方式分為氣套式和水套式具備相互獨(dú)立三重溫度控制功能的二氧化碳培養(yǎng)箱，即箱內(nèi)溫度控制、超溫報(bào)警控制和環(huán)境溫度監(jiān)控。

二氧化碳濃度控制紅外傳感器（IR）或熱導(dǎo)傳感器（TCD）

帶有CO2測量系統(tǒng)自動(dòng)校準(zhǔn)功能

防污染設(shè)計(jì)和消毒滅菌系統(tǒng)紫外消毒HEPA過濾器高溫消毒高溫干熱和高溫濕熱

高壓消毒鍋相關(guān)概念介紹滅菌（sterilization）是指殺滅一切活的微生物。消毒（disinfection）是指殺滅病原微生物和其他有害微生物，并不要求清除或殺滅所有微生物。方法滅菌方法可分為四種：物理、機(jī)械、化學(xué)和生物滅菌。一般多采用物理方法，如高溫?zé)崃?、濾過、超聲波、紫外線和電