蛋白質(zhì)折疊與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊課件

第三章:蛋白質(zhì)折疊第四章:細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊第三章:蛋白質(zhì)折疊一、蛋白質(zhì)復(fù)雜的三級結(jié)構(gòu)信息貯存于氨基酸序列中關(guān)于氨基酸序列與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系研究，最早的工作是由C.Anfinsen(1960)關(guān)于核糖核酸酶的研究工作他研究了核糖核酸酶的去折疊和重折疊過程。該酶是由124個氨基酸組成的蛋白質(zhì)有四對二硫鍵，其組合有105{[(24)!/244!]=105}種的可能方式。當(dāng)用還原劑如b-巰基乙醇(HOCH2-CH2-SH)作用時二硫鍵被部分還原，繼續(xù)加大b-巰基乙醇的量，二硫鍵可全部被還原。用8M的脲加b-巰基乙醇處理，多肽鏈分子內(nèi)四對二硫鍵可全部被還原，肽鏈伸展為無規(guī)卷曲，酶活性完全喪失。但如果將脲和b-巰基乙醇透析掉并在空氣中進行氧化，多肽鏈可又重新折疊為一個具有特定的三維結(jié)構(gòu)和催化活性的酶，它與未經(jīng)處理的酶具有相同的溶解度并可結(jié)晶并獲得相同的X-射線衍射圖，其吸收光譜也相同。這是一個很好的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列決定其三維結(jié)構(gòu)的例子即順序決定構(gòu)象二、關(guān)于蛋白質(zhì)折疊的理論模型各種實驗及理論計算均證明蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象在熱力學(xué)上是最穩(wěn)定的1、框架模型(Frameworkmodel):P.S.Kim和R.L.Baldwin于1982年提出了蛋白質(zhì)折疊的框架模型。該模型認為，在蛋白質(zhì)折疊的過程中大約有15個氨基酸殘基的多肽鏈首先折疊為瞬態(tài)的a螺旋或b片層結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)單元，然后這種瞬態(tài)的結(jié)構(gòu)通過擴散彼此接近形成aaab或bb的復(fù)合結(jié)構(gòu)而獲得穩(wěn)定這種復(fù)合結(jié)構(gòu)，又稱為折疊單元，折疊單元作為一個核心，吸引和穩(wěn)定其它擺動著的二級結(jié)構(gòu)單元形成折疊框架其它的側(cè)鏈將適應(yīng)這個框架。2疏水折疊模型(HydrophobicCollapseModel)和熔融球態(tài)模型(MoltenGlobuleModel):該模型提出折疊是由疏水折疊開始的。即四體石蠟的疏水片段首先聚集在一起，然后進一步聚集長大，形成一種稱為熔融球蛋白中間體，此種結(jié)構(gòu)是一種具有二級結(jié)構(gòu)，但很少有三級相互作用的結(jié)構(gòu)。疏水殘基有很大一部分暴露在溶劑中。加熱,酸或堿鹽,破壞不牢固的次級鍵，使蛋白質(zhì)功能喪失不可逆變性蛋白質(zhì)的變性失活核糖核酸酶可逆的變性:恢復(fù)到正確的折疊結(jié)構(gòu)恢復(fù)生物學(xué)的活性變性因素物理因素：加熱、加壓、超聲波、紫外線化學(xué)因素：胍、脲、有機溶劑、強酸強堿、SDS

-巰基乙醇、

重金屬離子生物堿試劑復(fù)性蛋白質(zhì)的變性程度較輕，去除變性因素后，又恢復(fù)了原有的空間構(gòu)象和生物活性,即可逆變性.四、蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)五、蛋白質(zhì)折疊的識別將一個新的順序與一個已知的特征化的,三維結(jié)構(gòu)花樣的疊合識別在大多數(shù)情況下是比較成功的，在某些情況下是相當(dāng)可靠的。尤其是當(dāng)兩個蛋白具有相同的重要氨基酸順序時，它們總是在那些區(qū)域具有相同的三維結(jié)構(gòu)。另一種折疊的識別方式即所謂的Threading。此方式主要是通過分析已知蛋白的由實驗所測得的三維結(jié)構(gòu)，來估計可允許的sub-in-del而非進行未知結(jié)構(gòu)與其同源家族的多重對齊。即用已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氨基酸類型的經(jīng)驗配對勢的大小，來衡量取代的可能性。簡言之，一個位置上可取代的容忍度，是通過某個位置上和其殘基周圍的所有位置上的氨基酸類型間的相互作用自由能來估計的第四章:細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊離體實驗并不能精確地反映細胞內(nèi)新生蛋白質(zhì)的實際折疊過程.離體情況下蛋白質(zhì)的去折疊后的再折疊(refolding)過程對蛋白質(zhì)濃度及物理化學(xué)條件的要求完全不同于在細胞內(nèi)所發(fā)生的情況

在離體情況下的再折疊實驗往往涉及到整條肽鏈,而在活體情況下則是當(dāng)新生肽段的N端在核糖體上一經(jīng)合成或剛從細胞膜上移位,折疊活動就開始了。3）在細胞中許多蛋白質(zhì)是以均一或不均一的寡體復(fù)合物就開始裝配，而在離體的情況下當(dāng)濃度如細胞內(nèi)那么低時形成復(fù)合物的可能性極小一）二硫鍵異構(gòu)酶(PDIase)PDIase是一種含有486個氨基酸殘基亞基的真核均二聚體酶(homodimericeukaryoticenzyme)。它有催化二硫鍵的鏈間交換使多肽鏈間的二硫鍵達到正確配對的功能。奇妙的是PDIase還是具有a2β2異四配體脯氨酰羥化酶(heterotetramerprolylhydroxylase)的β亞基，該羥化酶可使膠原蛋白的脯氨酸殘基羥化，其反應(yīng)的重要性目前尚不清楚在真核細胞中，二硫鍵在蛋白質(zhì)被輸運到細胞表面之前在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成。在細胞內(nèi)二硫鍵異構(gòu)酶proteindisulfideisomerase,PDI可催化內(nèi)二硫鍵的交換以防止形成不正確的二硫橋一）二硫鍵異構(gòu)酶(PDIase)結(jié)構(gòu)PDIisnowknowntocatalyzeallofthereactionsthatareinvolvedinnativedisulphidebondformation.Nativedisulphidebondformationisacomplexprocess.Disulphidebondsforming(oxidation)Incorrectbondsmustbebroken(reduction)orrearranged(isomerization).TheenzymePDIisamulti-domain,multi-functionalmemberofthethioredoxin(afamilyofsmallredoxactiveprotein)superfamily.PDIcancatalysethiol-disulphideoxidation,reductionandisomerization.Isomerizationoccursdirectlythroughintramoleculardisulphiderearrangementorthroughcyclesofreductionandoxidation.YeastPDIPDB:2B5EHumanPDIDomaina,a’,b,b’PDB:1ERTStructure

ofPDITianG.etalcell2006Structure&FunctionTheaanda’domainsbothadoptacanonicalthioredoxinfold;Thebandb’domainsbothdisplayminorvariationsfromthetypicalthioredoxinfold.Theinterfacebetweenthebandb’domainisextensivewithaburiedsurfaceareaof700?2,andtheinterfacesbetweentheaandbdomainsandtheb’anda’domainsareonly200?2.Theactivesitesintheaanda’domainspointateachother,butareseparatedbyalargeUshapecleft,andthedistancebetweenC61andC406is28?.Thereareseveralhydrophobicpatchesofsurroundingtheactivesitesintheaanda’domainsandeachofthebandb’domainshaveonehydrophobicpatchatthesamerelativesites.Theprimarysubstratebindingsitehasbeenmappedtotheb’domainformammalianPDI.Thehydrophobicpatchonthebdomainextendsthesubstratebindingsiteoftheb’domaintoformalargersubstratebindingplatform,whichislocatedbetweenthetwoactivesitesintheaanda’domains.Structure&Function圖4-1牛胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)

在胞外的蛋白質(zhì)折疊研究中二硫鍵的形成已被人們進行了較深入的研究三對二硫鍵分別被標以綠色，β鏈被標以藍色，a螺旋被標以紅色。該蛋白在完全還原狀態(tài)是非折疊的，只有再被完全氧化形成二硫鍵后才能重折疊圖4-2BPTI的折疊途徑

BPTI的折疊途徑：非折疊的蛋白在還原狀態(tài)有六個半胱氨酸殘基，主要的單二硫鍵中間體在殘基30和51之間，有一對二硫鍵。此中間體進一步形成雙二硫鍵中間體，此中間體含有非天然的二硫鍵，此中間體對天然二硫鍵中間體Cys30-Cys51和Cys5-Cys55的形成是主要的。一旦形成了這樣的雙二硫鍵中間體第三對天然二硫鍵Cys14-Cys38將會迅速形成圖4-5(a)肽單位可接受反式(trans-)和順式(cis-)兩種不同的構(gòu)象；(b)反式(trans-)和順式(cis-)脯氨酸。

脯氨酰順-反異構(gòu)酶(PPIs)催化順-和反-構(gòu)象之間Xaa-Pro肽鍵的慢互變，因此可加速含有脯氨酸的多肽鏈的折疊促進脯氨酸殘基順式多肽鍵的形成Cyclophilin可催化順和反脯氨酸的異構(gòu)。Cyclophilin提高了脯氨酸肽的順反異構(gòu)化作用的速率，與非酶作用相比大約提高了一百萬倍。雖然酶的作用的機理仍不清楚，但可以肯定的是它引起肽基團的變形和解聚Cyclophilin與一個含有脯氨酸的四肽的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)已解析。圖4-6Cyclophilin與一個含有脯氨酸的四肽復(fù)合物的結(jié)構(gòu)為一個八股的反平行β桶（藍色），兩段a螺旋（紅色）位于外部，與含有脯氨酸的四肽（綠色）結(jié)合的活性部位位于β桶的外部脯氨酸殘基緊緊地結(jié)合在結(jié)合溝的疏水口袋中，并且羧基端氧原子與蛋白質(zhì)的的堿性側(cè)鏈形成氫鍵，肽片段與疏水環(huán)境的結(jié)合，通過減少肽基團的電荷分離而促進了順反異構(gòu)化作用，并產(chǎn)生了具有單鍵特征的肽鍵，同時與Cyclophilin的緊密疏水相互作用，可使肽基團的幾何學(xué)上變形產(chǎn)生異構(gòu)化作用這兩種機理或它們的組合將減少繞肽鍵轉(zhuǎn)動的能壘。此能量是順反異構(gòu)化所必需的三、分子伴侶(Chaperone)非折疊蛋白含有大量的暴露于溶劑的疏水區(qū)域，并因此有形成分子內(nèi)和分子間聚集的傾向。分子伴侶就是一類具有阻止不正確的折疊或修正不正確折疊的蛋白質(zhì)，尤其是對于多結(jié)構(gòu)域蛋白和多亞基蛋白的不正確折疊分子伴侶起著極其重要的作用在細胞內(nèi)分子伴侶并不催化二級結(jié)構(gòu)的形成，而是在蛋白質(zhì)知折疊的過程中，去識別和穩(wěn)定部分折疊的中間物，使肽鏈進行裝配和去裝配。它們是通過與非折疊或聚集多肽的暴露于溶劑的疏水表面結(jié)合并逐步釋放它們來達到此目的圖4-7大腸桿菌PapD蛋白的晶體結(jié)構(gòu)

PapD是一個促進毛發(fā)蛋白合適組裝的分子伴侶，但不是它的組成部分。分子伴侶與毛發(fā)蛋白亞基C端的一個19肽的保守肽段的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)PapD蛋白由兩個結(jié)構(gòu)上相似的結(jié)構(gòu)域組成。球狀CPK模型表示的是毛發(fā)蛋白的保守多肽。該多肽與PapD蛋白的G1b鏈結(jié)合并顯示伸展的構(gòu)象。多肽鏈與蛋白之間以氫鍵連接，多肽鏈末端的羧基錨在PapD蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域的接點的分叉上，并通過氫鍵與蛋白的不變殘基Arg8(R8)和Lys112(K112)殘基結(jié)合，PapD的突變研究表明這些殘基的突變將使其喪失與毛發(fā)蛋白亞基結(jié)合的能力。G1b鏈的保守疏水殘基以綠色表示。從圖中我們可看到PapD蛋白有一個寬的裂縫，此裂縫含有幾個保守的暴露于溶劑的疏水殘基這些殘基在功能上是專一性地與PapD的靶肽片斷結(jié)合Chaperonesareaclassofproteinswhichbindtoincompletelyfoldedorassembledproteinsinordertoassisttheirfoldingorpreventthemfromaggregating.CrystalstructureofhumanHsp90-alpha.PDB:2h55Crystalstructureofthecarboxy-terminaldomainofhtpG,theE.coliHsp90PDB:1sf8CrystalStructureoftheMiddleDomainofHtpG,theE.coliHsp90PDB:2gq0CrystalStructureoftheN-terminalDomainofHtpG,theEscherichiacoliHsp90,BoundtoADPPDB:2IOR圖4-9由14個亞基排列為兩圈的柱形的分子伴侶GroEL分子的圖解該家族蛋白由14個分子量為60KD的亞基組成，這14個亞基排列成并列的兩個分別為7個亞基的環(huán)，每個環(huán)都有一個中心的腔該腔可容納下一個分子量為90KD的球狀蛋白，Hsp60蛋白與ATP結(jié)合并具有弱的ATP酶活性，起著穩(wěn)定折疊中間物的作用。因此可以阻止錯誤折疊的發(fā)生和錯誤結(jié)構(gòu)的形成，指導(dǎo)多肽鏈按正確的路線裝配Hsp60蛋白

(a)GroEL的亞基結(jié)構(gòu)(b)GroEL分子中四個亞基結(jié)構(gòu)域排列的圖示。近赤道結(jié)構(gòu)域形成分子的中間部分，并且是兩個七元環(huán)之間的參與反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域。頂點結(jié)構(gòu)域位于圓柱的頂端和底部，并形成一個開放的由頂部，貫串到底部的通道。小的連接結(jié)構(gòu)域在七元環(huán)的中部形成圓柱壁的最薄的部分

根據(jù)電子顯微鏡三維重構(gòu)圖形建立的在兩者不同的功能態(tài)情況下的GroEL分子的模型。GroEL的大的構(gòu)象變化發(fā)生在GroES和ATP結(jié)合時，GroES分子結(jié)合在一個GroEL環(huán)上并關(guān)閉了中央空腔，這樣GroEL環(huán)變大并且空腔內(nèi)部的腔變得更寬GroES結(jié)合在GroEL的頂點結(jié)構(gòu)域上關(guān)閉了GroEL的中央空腔。一旦GroES結(jié)合到GroEL分子的一個環(huán)上，GroES就發(fā)生了構(gòu)象變化，這降低了對第二個GroEL環(huán)的親和力，因此GroEL-GroES復(fù)合物的占優(yōu)勢的功能態(tài)是不對稱的即GroES僅結(jié)合在GroEL圓柱的一端，顯然GroEL分子的兩半之間有很強的結(jié)構(gòu)相關(guān)性GroES結(jié)合到一半的GroEL上將影響另一半的性質(zhì)盡管兩個GroES之間有大約150?的距離GroES分子由七個亞基組成。每個亞基由97個氨基酸殘基組成，七個亞基饒著一個七重軸，連接在一起與GroEL有相同的對稱性GroES的晶體結(jié)構(gòu)表明GroES的結(jié)構(gòu)象一個園屋頂(dome)，它的直徑大約為75?高度為30?并且在中央部分有一個小孔GroES的一個亞基的結(jié)構(gòu)

亞基結(jié)構(gòu)的核心是一個由兩個β折疊片互相堆積在一起的反平行β折疊片組成的β桶，有兩個大的環(huán)區(qū)域穿過此核心一個環(huán)區(qū)域伸展在環(huán)平面上，園屋頂?shù)捻敹烁采w了中央孔，另一個環(huán)區(qū)域富含疏水氨基酸殘基伸展到園屋頂之下與GroEL的頂點結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用。此環(huán)區(qū)域在X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)中是無序，的但核磁共振研究表明當(dāng)GroES結(jié)合到GroEL上時此環(huán)變得有序。突變研究也表明此環(huán)區(qū)域上的疏水殘基大約分子伴侶的功能是相當(dāng)重要的(a)一個非折疊的蛋白質(zhì)分子黃色結(jié)合到GroEL-ADP復(fù)合物紅色的一端，GroES分子綠色結(jié)合到復(fù)合物的另一端。(b和c)GroES從反方向被釋放然后與ATP一起重結(jié)合在GroEL的正向位置淺紅色。(d)在中央腔中蛋白正在折疊或去折疊時發(fā)生ATP的水解。(e)GroES和蛋白質(zhì)分子的釋放需要ATP的結(jié)合和在反方向的水解。(f)新的未折疊的蛋白質(zhì)分子重新結(jié)合到GroEL上有GroES正向位置結(jié)合的GroEL環(huán)受到很大的結(jié)構(gòu)變化，形成寬的由頂點結(jié)構(gòu)域和連接結(jié)構(gòu)域內(nèi)腔的壁形成的內(nèi)腔，此腔部分地由GroES園屋頂?shù)娜軇┧忾]。另一個反向位置的環(huán)有一個小的對溶劑開放的腔，未折疊的蛋白可以結(jié)合在環(huán)的正向或反向的位置上但僅僅結(jié)合在正向位置上的那些分子能適當(dāng)?shù)恼郫B重排，在反向位置的多肽鏈的結(jié)合和釋放似乎在功能上并不重要ATP-boundstatesofGroELcapturedbycryo-electronmicroscopySchematicDiagramofGroELFunctionalStates

(a)NonnativepolypeptidesubstratebindstoanopenGroELring.(b)ATPbindingtoGroELaltersitsconformation,weakensthebindingofsubstrate,andpermitsthebindingofGroEStotheATP-boundring.(c)ThesubstrateisreleasedfromitsbindingsitesandtrappedinsidethecavityformedbyGroESbinding.(d)Followingencapsulation,thesubstratefoldsinthecavityandATPishydrolysed.(e)AfterhydrolysisintheupperGroES-boundring,ATPandasecondnonnativepolypeptidebindtothelowerring,dischargingligandsfromtheupperringandinitiatingnewGroESbindingtothelowerring(f)toformanewfoldingactivecomplex