生物催化劑發(fā)現(xiàn)

上節(jié)課內(nèi)容復(fù)習(xí)生物催化定義：是利用生物催化劑(主要是酶或微生物)來改變(通常是加快)化學(xué)反應(yīng)速度的作用。生物催化轉(zhuǎn)化的分類：(1)發(fā)酵：用活細(xì)胞將原材料(如糖、淀粉或甲醇)轉(zhuǎn)化成更復(fù)雜的目標(biāo)產(chǎn)物。(2)前體發(fā)酵：發(fā)酵過程中添加前體物質(zhì)，并由活細(xì)胞將其轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物。(3)生物轉(zhuǎn)化：用酶或靜息細(xì)胞經(jīng)過一系列步驟，將前體轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物。(4)酶催化：提取粗酶或部分純化的酶，將底物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物。主底物輔助底物酶催化劑反應(yīng)介質(zhì)生物催化反應(yīng)體系主產(chǎn)品副產(chǎn)物生產(chǎn)率選擇率第二章生物催化劑的來源與篩選大綱2.1概述2.2微生物酶篩選的策略2.3微生物和酶的一般篩選方法2.4優(yōu)良菌種選育2.5從基因組DNA篩選酶的方法2.1概述2.1.1生物催化劑的概念1.生物催化劑：是生物反應(yīng)過程中起催化作用的游離或固定化酶的總稱。

2.分類

結(jié)構(gòu)形式細(xì)胞酶多細(xì)胞生物體游離型催化劑固定化催化劑2.1.2生物催化劑來源與多樣性生境的概念生物已知種類估計總種類百分比病毒50001300004細(xì)菌47604000012古細(xì)菌5000.1-1真菌6900015000005藻類400006000067苔蘚植物170002500068裸子植物750被子植物25000027000093原生動物30800100000312.1.3生物催化劑的尋找和發(fā)現(xiàn)提高篩選效率的基本原則①需要設(shè)計合適的用酶方法，使得目標(biāo)反應(yīng)非常清楚②需要在有希望的微生物中尋找具有合適活性的微生物③需要建立方便和敏感的分析系統(tǒng)盡可能多的搜尋微生物樣本。2.2微生物酶篩選的策略2.2.1常規(guī)生物催化劑篩選的一般策略設(shè)計反應(yīng)過程選擇合適的酶或產(chǎn)酶微生物建立有效且方便的分析方法生物催化劑篩選的反應(yīng)過程的設(shè)計圖2-1海因酶和N-氨基甲酰氨基酸水解酶兩步選擇性水解制備D-對羥基苯基甘氨酸生物催化劑篩選的反應(yīng)過程的設(shè)計例：①生物法：腈水合酶與酰胺酶催化反應(yīng)生產(chǎn)丙烯酰胺CH2＝CH－COOHCH2＝CH－CN腈水合酶H2OCH2＝CH－CONH2H2O酰胺酶②傳統(tǒng)法：銅催化丙烯腈的水合生產(chǎn)丙烯酰胺除去O2丙烯腈水水合作用濃縮除去Cu離子，脫色丙烯酰胺產(chǎn)物催化劑的回收制備催化劑的分離未反應(yīng)的丙烯腈酶或產(chǎn)酶微生物的篩選一般產(chǎn)酶微生物篩選的原則①能夠通過發(fā)酵在相對較短的時間內(nèi)高產(chǎn)目標(biāo)酶；②微生物應(yīng)該盡可能地利用便宜和方便的原料生產(chǎn)酶；③微生物所產(chǎn)生的酶最好有比較高的專一性④所采用的微生物應(yīng)該是不產(chǎn)生有害物質(zhì)的非致病性的安全微生物⑤微生物的遺傳穩(wěn)定性應(yīng)該比較高生物催化劑篩選的主要途徑

（1）從商品酶庫中篩選

（2）從已知菌種來源和菌種保藏中心篩選生物催化劑

（3）從自然界發(fā)現(xiàn)和篩選產(chǎn)酶微生物

（4）從基因庫篩選丹麥的NovoNordisk公司和美國的"Genecor國際公司"兩家。它們的銷售額分別占世界酶制劑市場份額的44%和29%。英荷合資的皇家DSM-吉斯特公司近年來已迅速崛起并成為全球第3大酶制劑生產(chǎn)企業(yè)。該公司的酶制劑銷售額約占世界酶制劑市場的15~19%。至于其它中小型酶制劑公司只能分享10%不到的酶制劑市場份額。從商品酶庫中篩選英文簡稱

中文全稱

所屬單位

所在地

ACCC中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所

北京

CCCAU中國農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏中心

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

北京

CCTCC中國典型培養(yǎng)物保藏中心

武漢大學(xué)

武漢

CCVCC中國普通病毒保藏管理中心

中國科學(xué)院武漢病毒研究所

武漢

CFCC中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心

中國林業(yè)科學(xué)院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所

北京

CGMCC中國普通微生物菌種保藏管理中心

中國科學(xué)院微生物研究所

北京

CICC中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心

中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院

北京

CMCC中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心

中國藥品生物制品檢定所

北京

CMMC中國海洋微生物保藏中心

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所

CPCC中國藥用微生物菌種保藏管理中心

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所

北京

CVCC中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所

北京

MCCC中國海洋微生物菌種保藏管理中心

國家海洋局第三海洋研究所

廈門

SIIA四川抗菌素工業(yè)研究所

成都

從已知菌種來源和菌種保藏中心篩選ATCC美國典型菌種收藏中心

AmericanTypeCultureCollectionUSAIFO

日本大阪發(fā)酵研究所InstituteforFermentationOsaka,JapanKCTC

KoreanCollectionforTypeCulturesKoreaFDA美國食品與藥品管理局

FoodanddrugAdministrationUSANIHJ

NationalInstituteofHealthJapanNIH美國國立衛(wèi)生研究院

NationalInstituteofHealthUSAVKM

RussianCollectionofMicroorganismsRussiaNRCA

NationalResearchCenterofAntibioticsRussiaNCTC

NationalCollectionofTypeCultureUnitedKingdomNCYC英國國家酵母菌種收藏中心

NationalCollectionofYeastCultureUnitedKingdom從已知菌種來源和菌種保藏中心篩選建立有效和方便的篩選分析方法成功的選擇方法是基于目標(biāo)酶活而精心設(shè)計的。為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。初篩的目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。平皿快速檢測法平皿快速檢測法是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的"形態(tài)"變化。具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等，。這些方法較粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初篩，但它們可以大大提高篩選的效率。從自然界發(fā)現(xiàn)和篩選產(chǎn)酶微生物初篩（一）目的：得到具有潛在應(yīng)用價值的目的微生物。初篩

一次或多次從現(xiàn)有菌群中把多數(shù)無用的微生物淘汰，把少量有用的微生物篩選出來。（二）要求：快速——有預(yù)測或預(yù)見敏捷——迅速處理好眾多的樣品。經(jīng)濟(jì)——得到有廣泛目標(biāo)的有用微生物。二初篩（三）篩選方法瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)出群體后初篩。1用PH指示劑檢測有無有機(jī)酸或胺類。

中性麝香草酚藍(lán):PH＜6.0黃,PH＞7.6藍(lán),PH6.0~7.0綠2在培養(yǎng)基中加入碳酸鈣檢測有機(jī)酸。可在菌群周圍形成清晰的碳酸鈣溶解區(qū)。3在培養(yǎng)基中加入底物檢測細(xì)胞外酶、酶抑制劑等特定的底物可以與細(xì)胞外酶形成顯色反應(yīng)；酶的反應(yīng)對特定底物形成溶解或沉淀。復(fù)篩1微生物初篩鑒定2發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇3培養(yǎng)與發(fā)酵4抽提試驗復(fù)篩培養(yǎng)與發(fā)酵（1）試管培養(yǎng)試管搖床培養(yǎng)。常用。目的：原種斜面培養(yǎng)后，為了提高初篩效率。（2）搖瓶培養(yǎng)（搖瓶發(fā)酵）250或500ml錐形瓶再200rpm搖床上培養(yǎng)。目的：培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的初篩。

培養(yǎng)與發(fā)酵（3）玻璃自控發(fā)酵罐容量5～50L。是搖床向發(fā)酵罐的過渡階段。目的：工藝參數(shù)、工藝條件的選擇和考察。（4）試驗罐培養(yǎng)中間工業(yè)試驗階段目的：放大和驗證搖床試驗結(jié)果，積累發(fā)酵工藝規(guī)律和發(fā)酵參數(shù)。為工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)打基礎(chǔ)培養(yǎng)與發(fā)酵（5）發(fā)酵試驗的三個階段2.2.2從極端微生物中篩選極端酶的策略極端酶（extremozyme）是由極端微生物（extremophile）產(chǎn)生的酶，與之相對應(yīng)的中間型是常態(tài)微生物（mesophilicorganism）產(chǎn)生的酶。如何進(jìn)行極端酶的研究和開發(fā)①必須有足夠的酶，這就涉及極端微生物的培養(yǎng)②依賴極端酶在中間宿主中的表達(dá)極端環(huán)境中的微生物極端環(huán)境：高等動植物不能生長，大多數(shù)微生物不能生活的高溫、低溫、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、高鹽、高壓、高輻射、等特殊環(huán)境。◆1種類：極端嗜熱菌，最適生長溫度90～105℃，高達(dá)110℃

極端嗜冷菌，可在零下70～80攝氏度度生長。

極端嗜鹽菌，新疆鹽湖中的可耐受20～30％的NaCl

極端嗜堿菌，PH9～10

極端嗜壓菌，在深海底，生活壓力7.1～8.1×107Pa◆3應(yīng)用

開采石油：嗜壓菌產(chǎn)氣增壓降低原油粘度。生產(chǎn)特殊酶制劑：嗜堿細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶作為洗滌劑的添加劑

環(huán)境保護(hù)：嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)生的木聚糖酶能夠水解木聚糖產(chǎn)生木糖和寡聚糖，可用來處理人造纖維廢物

遺傳工程以及基因技術(shù)：從水生棲熱菌中提取耐熱的TaqDNA聚合酶◆2特性都為古細(xì)菌。具有不同于一般微生物底遺傳機(jī)制、特殊底細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理功能。表2-1某些有應(yīng)用前景的超級嗜高溫酶酶功能酶活力的最適溫度/℃葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖→果糖，生產(chǎn)高果糖糖漿95木聚糖酶木漿和紙生產(chǎn)中水解木聚糖105α-淀粉酶淀粉水解85~90纖維二糖水解酶纖維素水解105β-葡聚糖酶A，β-葡聚糖酶B纖維素水解95β-甘露聚糖酶甘露聚糖水解92α-半乳糖苷酶半乳甘露聚糖水解100~105β-葡萄糖苷酶纖維二糖水解105β-木糖苷酶木二糖水解未定β-半乳糖苷酶乳糖水解802.2.3未培養(yǎng)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)策略未培養(yǎng)微生物（unculturedmicroorganism）美國微生物學(xué)家Colwell的實驗室在1982年首先提出“不能培養(yǎng)微生物（nonculturablemicroorganism）”的概念，他們發(fā)現(xiàn)快速生長的霍亂弧菌和大腸桿菌移植到無營養(yǎng)料的鹽水中，經(jīng)長時期的低溫保存后，細(xì)胞數(shù)不減，代謝活力不變，但在正常肉湯培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生菌落，因此他們用“活的但不能培養(yǎng)（viablebutnonculturable,VBNC)”一語描述這種潛伏狀態(tài)的細(xì)菌。

2.3微生物和酶的一般篩選方法2.3.1從自然界發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶微生物采樣富集培養(yǎng)：是根據(jù)微生物的生理特點，在目的微生物含量較少時，設(shè)計一種選擇型培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，是目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種。分為分批式（搖瓶培養(yǎng)）和恒化式（連續(xù)培養(yǎng)）兩種不同的方式。分離篩選圖2-2從自然界發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶微生物的方法2.3.2生物催化劑的高效篩選高通量篩選（high-throughscreening,HTS）是近年來發(fā)展起來的一種新型篩選技術(shù)，其特點是微量、快速、靈敏、準(zhǔn)確，在短時間內(nèi)可以檢測大量的微生物。2.4優(yōu)良菌種選育優(yōu)良生產(chǎn)菌種應(yīng)該具備的基本特點：①生產(chǎn)菌種應(yīng)該具備在較短的發(fā)酵周期內(nèi)產(chǎn)生大量發(fā)酵物②在發(fā)酵過程中不產(chǎn)生或少產(chǎn)生與目標(biāo)產(chǎn)品性質(zhì)相近的反應(yīng)產(chǎn)物或副產(chǎn)物，以便于分離純化。③能利用多種來源的原材料，并對發(fā)酵原料成分的波動敏感性較小，可用價廉易得的原材料進(jìn)行培養(yǎng)，以降低發(fā)酵成本。④對需要添加的前體物質(zhì)（底物）有耐受力，并且不將底物、產(chǎn)物作為一般碳源利用。⑤具有抗雜菌污染，抗噬菌體感染的能力。⑥發(fā)酵泡沫少，利于提高裝料系數(shù)、提高單罐產(chǎn)量、降低發(fā)酵成本⑦生長繁殖能力強(qiáng)