發(fā)酵工程制藥

第三章發(fā)酵工程制藥第一節(jié)概述發(fā)酵工程

FermentationEngineering

1微生物發(fā)酵技術(shù)

1857年法國化學(xué)家、微生物家巴斯德提出了著名的發(fā)酵理論：“一切發(fā)酵過程都是微生物作用的結(jié)果?！卑退沟抡J(rèn)為，釀酒是發(fā)酵，是微生物在起作用；酒變質(zhì)也是發(fā)酵，是另一類微生物在作祟；隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以用加熱處理等方法來殺死有害的微生物，防止酒發(fā)生質(zhì)變。

同時(shí)，也可以把發(fā)酵的微生物分離出來，通過人工培養(yǎng)，根據(jù)不同的要求去誘發(fā)各種類型的發(fā)酵，獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)品。

2一、發(fā)酵的定義1、傳統(tǒng)發(fā)酵2、生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵3、工業(yè)上的發(fā)酵31、傳統(tǒng)發(fā)酵

最初發(fā)酵是用來描述酵母菌作用于果汁或麥芽汁產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象，或者是指酒的生產(chǎn)過程。42、生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵指微生物在無氧條件下，分解各種有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生能量的一種方式，或者更嚴(yán)格地說，發(fā)酵是以有機(jī)物作為電子受體的氧化還原產(chǎn)能反應(yīng)。如葡萄糖在無氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出CO2。53、工業(yè)上的發(fā)酵

泛指利用微生物制造或生產(chǎn)某些產(chǎn)品的過程包括：1.厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如酒精，乳酸等。2.通氣（有氧）培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等。產(chǎn)品有細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也包括菌體細(xì)胞、酶等。6發(fā)酵工程定義

發(fā)酵工程是滲透有工程學(xué)的微生物學(xué)。它是一門將微生物學(xué)、生物化學(xué)和化學(xué)工程學(xué)的基本原理有機(jī)的結(jié)合起來，利用微生物的生長和代謝活動(dòng)來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)。由于它以培養(yǎng)微生物為主，所以又稱微生物工程。是將傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)與DNA重組、細(xì)胞融合、分子修飾和改造等新技術(shù)結(jié)合并發(fā)展起來的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)。7發(fā)酵工程制藥的研究范疇1、抗生素2、維生素3、氨基酸4、核苷或核苷酸5、藥用酶和輔酶6、其它藥理活性物質(zhì)8維生素發(fā)酵生產(chǎn)的維生素，1982年世界產(chǎn)量為6萬噸左右，六種維生累的總銷額為6.7億美元。在1969—1980年間，每年銷售量遞增10×，1981—1991年間仍以7一8％的速率遞增。目前，全球范圍內(nèi)使用最為普遍的是VA、VC和VE，三都每年市場銷售額近20億美元，其中VE超過10億美元，其余為VB族，每個(gè)品種都有0.5-1.5億美元的市值。在各種用途中，維生素作為動(dòng)物飼料的市場正以每年2-3％速度增長，在藥用和食品領(lǐng)域都以4-5％的速度增長。9發(fā)酵工程的生產(chǎn)流程發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)過程：原料預(yù)處理培養(yǎng)基配置發(fā)酵設(shè)備和培養(yǎng)基的滅菌無菌空氣的制備菌種的制備和擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵（微生物培養(yǎng)）發(fā)酵產(chǎn)品的分離和純化10菌種制備1112工藝特點(diǎn)與要求A.菌種制備品系純正、生產(chǎn)能力高、遺傳穩(wěn)定無污染、生命力強(qiáng)、保存期短嚴(yán)格消毒滅菌定期分離復(fù)壯冷凍干燥管或液氮管保存菌種13菌種篩選搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)純種培養(yǎng)14微生物菌種保藏技術(shù)

在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。15一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1)

經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；(2)

保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。16一、微生物菌種保藏在一定時(shí)間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：基本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥17

由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，因此，在具體選擇保藏方法時(shí)必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點(diǎn)及現(xiàn)有條件等進(jìn)行綜合考慮。

對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。18國際重要菌種保藏機(jī)構(gòu)19中國菌種保藏單位2021二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

(1)超低溫或在液氮中冷凍保藏；(2)冷凍干燥或真空干燥保藏；(3)

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?/p>

(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏22菌種保藏方法暫時(shí)保藏法

斜面?zhèn)鞔?/p>

穿刺法長期保藏法

液體石蠟法甘油管法砂管保藏法

砂土管保藏法濾紙片保藏法

冷凍干燥保藏法

液氮冷凍法

232.1

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20℃以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。24冷凍保藏種類

一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60-80℃)三、液氮冷凍保藏技術(shù)

25普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中?；蛘撸瑢⒕N培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年26應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。27二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60--80℃)要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。28如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。29三、液氮冷凍保藏技術(shù)

(一)冷凍保護(hù)劑

在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。

30(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟

1．待冷凍保藏菌種懸液的制備

(1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶。

31(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。32

2．控速冷凍．(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；33(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。34(三)復(fù)蘇1．從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解；3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。352.2

凍干保藏

冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。36培養(yǎng)物的凍干過程37冷凍真空干燥操作流程安培瓶配制保護(hù)劑滅菌菌種培養(yǎng)制備菌懸液分裝安培瓶洗凈烘干裝標(biāo)簽加棉塞預(yù)凍真空干燥測定水分熔封管口檢查真空度包藏38(三)凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺(tái)中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿。39(3)在安瓿中加入0.5～1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。402.3傳代保藏將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法?？捎糜趯?shí)驗(yàn)室中若干菌種的保藏。此法最為簡單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。412.3傳代培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)原理：保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細(xì)菌）培養(yǎng)好后，置4C?冰箱中存放，定期進(jìn)行傳代培養(yǎng)、再存放?？捎媚z塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進(jìn)一步延長保存期。操作方法

1、斜面保藏法將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2－4個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，普通細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、使用方便，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、易被污染。422、液體石蠟保藏法將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法實(shí)用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長好后用膠塞封嚴(yán)，置4℃冰箱存放。43礦物油中浸沒保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡便有效?？捎糜诮z狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。44浸沒保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經(jīng)170℃下滅菌1-2h的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時(shí)，應(yīng)對需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn)。因?yàn)槟承┚暝谝后w石蠟下生長還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會(huì)同化液體石蠟，也有的對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預(yù)防不測，一般保藏株2～3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。452.4載體法

實(shí)驗(yàn)原理：使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。46操作方法（砂土管保藏法）（1）河砂處理取河砂若干加入鹽酸10%，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。（２）土壤處理取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。

(3)砂土混合處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次)，最后烘干。472.4

基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)粒基因通常為宿主細(xì)胞生長非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長速度會(huì)加快。48當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。49不同菌種保藏方法比較50細(xì)菌的保藏51放線菌菌種的保藏保藏方法主要有：

沙土管法、冷凍干燥法、液氮冷凍法放線菌菌種的長期保藏依保藏放線菌的分生孢子為主要方式。52發(fā)酵原料的預(yù)處理原料不同處理方法也有所差異。1.淀粉——利用前需變成糊精或葡萄糖。方法：酸水解（高壓、耐酸）、酶水解法2.糖蜜——加熱殺菌和用水沖稀，也可加酸處理后再補(bǔ)充無機(jī)鹽。3.碳?xì)浠衔铮菏兔撓灐欢s分的石油經(jīng)冷卻脫蠟而獲得的凝固點(diǎn)在-10℃的油，加入適量無機(jī)鹽進(jìn)行接種發(fā)酵。53菌種斜面培養(yǎng)菌種：已有的優(yōu)良生產(chǎn)菌種和選育的新菌種。方法：一般都是由保存于冷凍管及砂土管或冰箱中的斜面菌種開始，在正式使用前要先轉(zhuǎn)接到新鮮斜面培養(yǎng)基上活化后，再用于種子擴(kuò)大培養(yǎng)。保存的菌種菌種活化種子擴(kuò)大培養(yǎng)54種子擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)的方法可以根據(jù)需要采用固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)兩級不同方式。固體種子擴(kuò)大培養(yǎng)一般采用傳統(tǒng)的制曲工藝，一般先用克氏瓶或茄子瓶進(jìn)行擴(kuò)大，再轉(zhuǎn)接到曲盤擴(kuò)大培養(yǎng)。需氧微生物：將克氏瓶表面培養(yǎng)的菌種接到裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在搖床上振蕩培養(yǎng)。厭氧微生物：將有菌種的試管斜面或克氏瓶轉(zhuǎn)接到三角瓶液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)?？耸掀亢颓炎悠?5搖瓶克氏瓶和茄子瓶搖床培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)是一種能保證好氧菌獲得充足溶解氧的液體培養(yǎng)方法56

菌種的衰退與復(fù)壯

在生物進(jìn)化的歷史長河中，遺傳性的變異是絕對的，而它的穩(wěn)定性反而是相對的；退化性的變異是大量的，而進(jìn)化性的變異卻是個(gè)別的。在自然情況下，個(gè)別的適應(yīng)性變異通過自然選擇就可保存和發(fā)展，最后成為進(jìn)化的方向；在人為條件下，人們也可以通過人工選擇法去有意識地篩選出個(gè)別的正變體用于生產(chǎn)實(shí)踐中。相反，如不自覺、認(rèn)真地去進(jìn)行人工選擇，大量的自發(fā)突變菌株就會(huì)趁機(jī)泛濫，最后導(dǎo)致菌種的衰退（degeneration）。

57在長期接觸菌種的實(shí)際工作人員中，都有這樣的體會(huì)，即如果對菌種工作長期放任自流，不搞純化、復(fù)壯（rejuve-nation）和育種，則菌種就會(huì)對你進(jìn)行“懲罰”，反映到生產(chǎn)上就會(huì)出現(xiàn)持續(xù)的低產(chǎn)、不穩(wěn)產(chǎn)。這說明菌種的生產(chǎn)性狀也是不進(jìn)則退的。58菌種衰退的表現(xiàn)對產(chǎn)量性狀來說，菌種的負(fù)變就是衰退。其他原有的典型性狀變得不典型時(shí)，也是衰退。最易覺察到的是菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變。生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力的下降。衰退還表現(xiàn)在抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體、抗低溫等）能力的減弱等。

59菌種衰退的實(shí)質(zhì)菌種的衰退是發(fā)生在細(xì)胞群體中的一個(gè)由量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時(shí)，在一個(gè)大群體中僅個(gè)別細(xì)胞發(fā)生負(fù)變，這時(shí)如不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采取有效措施，而一味移種傳代，則群體中這種負(fù)變個(gè)體的比例逐步增大，最后讓它們占了優(yōu)勢，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的衰退。所以，在開始時(shí)所謂“純”的菌株，實(shí)際上其中已包含著一定程度的不純因素；同樣，到了后來，整個(gè)菌種雖已“衰退”了，但也是不純的，即其中還有少數(shù)尚未衰退的個(gè)體存在著。60復(fù)壯的概念狹義的復(fù)壯僅是一種消極的措施，它指的是在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定生產(chǎn)性能等方法，從衰退的群體中找出少數(shù)尚未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的一種措施；而廣義的復(fù)壯則應(yīng)是一項(xiàng)積極的措施，即在菌種的生產(chǎn)性能尚未衰退前就經(jīng)常有意識地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以，這實(shí)際上是一種利用自發(fā)突變（正變）不斷從生產(chǎn)中進(jìn)行選種的工作。

61二、菌種的衰退與復(fù)壯1）從衰退的菌種群體中把少數(shù)個(gè)體再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種。2）有意識地利用微生物會(huì)發(fā)生自發(fā)突變的特性，在日常的菌種維護(hù)工作中不斷篩選“正變”個(gè)體。大量群體中的自發(fā)突變菌種的復(fù)壯：a）純種分離；b）通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯；菌種衰退的特點(diǎn)：62實(shí)踐中關(guān)于防止菌種衰退和進(jìn)行復(fù)壯的經(jīng)驗(yàn)

（一）衰退的防止

1．控制傳代次數(shù)

2．創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件

在實(shí)踐中，有人發(fā)現(xiàn)如創(chuàng)造一個(gè)適合原種的生長條件，就可在一定程度上防止菌種衰退。如改變培養(yǎng)基成分、改變培養(yǎng)溫度等。3．利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代。用滅過菌的棉團(tuán)進(jìn)行孢子接種，不同孢子的接種嘗試。634．采用有效的菌種保藏方法，有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌種生產(chǎn)性狀的衰退

64（二）菌種的復(fù)壯

1．純種分離。通過純種分離，可把退化菌種的細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，就可恢復(fù)原菌株的典型性狀。

65方法662．通過宿主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯。對于寄生性微生物的退化菌株，可通過接種至相應(yīng)的昆蟲或動(dòng)、植物宿主體內(nèi)的措施來提高它們的致病性。

3．淘汰已衰退的個(gè)體，如低溫抗性篩選67發(fā)酵工藝的特點(diǎn)與要求原料要求質(zhì)量穩(wěn)定原材料、設(shè)備、空氣要嚴(yán)格滅菌設(shè)備密封性好無菌壓縮空氣分階段控制68無菌空氣的制備空氣除菌：針對好氧發(fā)酵空氣除菌過程高空采風(fēng)空氣壓縮機(jī)加壓滅菌（加熱或過濾）69提煉工藝的特點(diǎn)與要求低溫、清潔、嚴(yán)格控制環(huán)境工藝組合優(yōu)選質(zhì)量把關(guān)安全意識嚴(yán)格的無菌概念70酵母生產(chǎn)燃料乙醇71第二節(jié)抗生素類藥物概述抗生素：antibiotics

由微生物或高等動(dòng)植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類代謝物，以及甚至用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下萬種。72抗生素的發(fā)現(xiàn)很早以前，人們就發(fā)現(xiàn)某些微生物對另外一些微生物的生長繁殖有抑制作用，把這種現(xiàn)象稱為抗生。隨著科學(xué)的發(fā)展，人們終于揭示出抗生現(xiàn)象的本質(zhì)，從某些微生物體內(nèi)找到了具有抗生作用的物質(zhì)，并把這種物質(zhì)稱為抗生素，如青霉菌產(chǎn)生的青霉素，灰色鏈絲菌產(chǎn)生的鏈霉素都有明顯的抗菌作用。73抗生素殺菌作用抗生素殺菌作用主要有4種機(jī)制

抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成：抑制細(xì)胞壁的合成會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂死亡，以這種方式作用的抗菌藥物包括青霉素類和頭孢菌素類，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，不受這些藥物的影響。

與細(xì)胞膜相互作用：一些抗菌素與細(xì)胞的細(xì)胞膜相互作用而影響膜的滲透性，這對細(xì)胞具有致命的作用。以這種方式作用的抗生素有多粘菌素和短桿菌素。

干擾蛋白質(zhì)的合成：干擾蛋白質(zhì)的合成意味著細(xì)胞存活所必需的酶不能被合成。干擾蛋白質(zhì)合成的抗生素包括福霉素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和氯霉素。

抑制核酸的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制：抑制核酸的功能阻止了細(xì)胞分裂和/或所需酶的合成。以這種方式作用的抗生素包括萘啶酸和二氯基吖啶。74命名、分類命名:按動(dòng)植物學(xué)、菌屬學(xué)名稱定：青霉素

按化學(xué)結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的族名定：四環(huán)素紀(jì)念意義：地名、習(xí)慣俗名：井岡霉素分類：a.按來源分：真菌、細(xì)菌、放線菌、動(dòng)植物

b.按作用對象分：抗革蘭氏陽性菌（G﹢菌）抗革蘭氏陰性菌（Gˉ菌）、

抗腫瘤、抗真菌、抗結(jié)核分支桿菌、抗病毒、噬菌體及原蟲

c.按作用機(jī)制分：抑制細(xì)菌壁、細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)合成、核酸、生物能作用等

d.按化學(xué)結(jié)構(gòu)分：β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)類、氨基糖苷類、多烯大環(huán)類、多肽類、苯羥基胺類、蒽環(huán)類、其他等75青霉素青霉素又被稱為青霉素G、peillinG、盤尼西林、配尼西林、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀。

青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素類抗生素是β-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱。但它不能耐受耐藥菌株(如耐藥金葡)所產(chǎn)生的酶，易被其破壞，且其抗菌譜較窄，主要對革蘭氏陽性菌有效。青霉素G有鉀鹽、鈉鹽之分，鉀鹽不僅不能直接靜注，靜脈滴注時(shí)，也要仔細(xì)計(jì)算鉀離子量，以免注入人體形成高血鉀而抑制心臟功能，造成死亡。

76四環(huán)素從放線菌金色鏈叢菌（Streptomycesaureofa-ciens）的培養(yǎng)液等分離出來的抗菌物質(zhì)，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用，是一種廣譜抗菌素，對結(jié)核菌、變形菌等則無效。作用機(jī)制是與核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，而阻止氨酰基tRNA同核蛋白體結(jié)合。

77抗生素的抗菌譜指一種或一類抗生素（或抗菌藥物）所能抑制（或殺滅）微生物的類、屬、種范圍。如青霉素的抗菌譜主要包括革蘭陽性菌和某些陰性球菌，鏈霉素的抗菌譜主要是部分革蘭陰性桿菌。窄譜抗生素廣譜抗菌素：四環(huán)素類的抗菌譜覆蓋面廣，包括一些革蘭陽性和陰性細(xì)菌，以及立克次體、支原體、衣原體等78抗生素的劑量表示法效價(jià)單位：抗生素的活性表示方法每毫升或每毫克中所含某種抗生素的

有效成分理論效價(jià)、實(shí)際效價(jià)表示方法：a.稀釋單位：最高稀釋度、最小劑量U/ml;U/mg初期表示方法

b.質(zhì)量單位：以有效成分的質(zhì)量作為抗生素的單位U/mg79常用抗生素的理論效價(jià)

多為1μg作為一個(gè)單位，如鏈霉素、土霉素、紅霉素等1000U/mg同一類抗生素各種鹽類效價(jià)可根據(jù)分子量進(jìn)行換算鏈霉素堿1000U／mg

土霉素堿1000U／mg紅霉素堿1000U／mg

金霉素鹽酸鹽1000U／mg

四環(huán)素鹽酸鹽1000U／mg青霉素鈉1667U／mg

80第三節(jié)抗生素藥物的生產(chǎn)一、β-內(nèi)酰胺類分子內(nèi)含β-內(nèi)酰胺環(huán)—具抗菌活力與細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白(PBPS)結(jié)合、抑制形成肽聚糖應(yīng)用最廣泛、品種最多代表：青霉素和頭孢菌素81β-內(nèi)酰胺類抗生素的基本結(jié)構(gòu)特征82β-內(nèi)酰胺類抗生素作用機(jī)制細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)

所有的細(xì)菌都具有環(huán)繞著細(xì)胞膜的細(xì)胞壁。細(xì)胞壁的主要功能是：保持細(xì)胞形態(tài)，以及保護(hù)細(xì)胞免受由于環(huán)境滲透壓變化造成的細(xì)胞溶解。傳統(tǒng)地可以把細(xì)菌分為革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和耐酸菌三種。

83β-內(nèi)酰胺類抗生素作用機(jī)制在這三種細(xì)菌的細(xì)胞壁中都具有肽聚糖組分，其由N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramicacid，NAM））和N-葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，NAG）。

NAM和NAG緊密連接成線狀，線與線之間通過連接在NAM和NAG上的內(nèi)肽橋的連接成片狀（圖），片與片的堆積成為細(xì)胞壁的肽聚糖（圖）。

84肽聚糖片的形成85β-內(nèi)酰胺類抗生素作用機(jī)制近年來對細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的細(xì)胞膜上有特殊的蛋白質(zhì)分子，能與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合，被稱之為青霉素結(jié)合蛋白(PenicillinBondingProteins，PBPs)，抑制交聯(lián)形成肽聚糖。它具有很高的轉(zhuǎn)肽酶和羥肽酶活力，是這類抗生素抑制作用的靶蛋白。86β-內(nèi)酰胺類抗生素的性質(zhì)物理性質(zhì)：結(jié)晶固體羧基以游離酸存在時(shí)，易溶于有機(jī)溶劑—提取羰基具有較高紅外光譜振動(dòng)頻率——鑒別化學(xué)性質(zhì)：開環(huán)反應(yīng)易進(jìn)行，與醇類作用較快——重結(jié)晶87青霉素的生產(chǎn)工藝1.生產(chǎn)孢子制備產(chǎn)黃青霉菌孢子高產(chǎn)青霉菌的獲得：1943年在一個(gè)發(fā)霉的甜瓜上分離到一種產(chǎn)黃青霉菌，產(chǎn)量也只有20單位/ml，因此價(jià)格非常昂貴。后來該菌株經(jīng)X－射線和紫外線誘變處理后得到一變異株WisQ176，青霉素產(chǎn)量最高達(dá)1500單位/ml，為挽救在第二次世界大戰(zhàn)中戰(zhàn)傷受細(xì)菌感染而瀕臨死亡的傷員生命,發(fā)揮了重大的作用。目前工業(yè)生產(chǎn)上采用的生產(chǎn)菌種均為該變種通過采用理化因素不斷進(jìn)行誘變選育，當(dāng)前青霉素發(fā)酵產(chǎn)量已達(dá)50000—60000單位/ml的高水平88青霉素的發(fā)酵工藝流程產(chǎn)黃霉菌斜面孢子米孢子種子罐發(fā)酵罐發(fā)酵液發(fā)酵濾液真空冷凍干燥或液氮保藏孢子瓊脂斜面培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7~9d斜面孢子懸浮液接種于大米或小米基質(zhì)25℃培養(yǎng)6~7d孢子懸浮液接種26℃通氣攪拌培養(yǎng)60~68h10-15%體積接種在25通氣攪拌補(bǔ)料分批培養(yǎng)200~240h冷卻至5℃絮凝、過濾補(bǔ)料：葡萄糖硫酸銨氨水、苯乙酸消泡劑89青霉素的提煉工藝流程溶劑萃取法低溫、快速、嚴(yán)格控制PH、減少污染發(fā)酵液冷卻除雜萃取結(jié)晶干燥90二、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的生產(chǎn)最初使用的大環(huán)內(nèi)酯是紅霉素，它是禮來公司的研究隊(duì)在菲律賓怡朗的土壤中，從紅霉素鏈霉菌中抽取出來。并于1952年，在美國首次以月桂酰的商標(biāo)出售紅霉素、碳霉素、酒霉素、麥迪霉素、竹桃霉素、螺旋霉素等。竹桃霉素9192大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的作用機(jī)制一般認(rèn)為：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為蛋白質(zhì)合成抑制劑，即阻斷50S中肽酰轉(zhuǎn)移酶中心的功能，使P位上的肽酰tRNA不能與A位上的氨基酰tRNA結(jié)合形成肽鍵(如圖所示)。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與50S核糖體亞單位可逆性地結(jié)合，阻斷肽鏈的延伸

93分類1.多氧大環(huán)內(nèi)酯類抗生素根據(jù)碳原子數(shù)目分為3類：12元環(huán)、14元環(huán)和16元環(huán)大部分為堿性：醫(yī)療用14元環(huán)：紅霉素、竹桃霉素16元環(huán)：吉他霉素、螺旋霉素2.多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素根據(jù)所含共軛雙鍵的數(shù)目分為四烯、五烯、六烯、七烯等類抗菌活力隨共軛雙鍵數(shù)目的增加而增加可引起真菌細(xì)胞膜通透性的改變、導(dǎo)致致病菌死亡，而對細(xì)菌無效3.蒽沙大環(huán)內(nèi)酯類抗生素共同的結(jié)構(gòu)：環(huán)橋化合物利福霉素94紅霉素Erythromycin抗菌譜與青霉素近似，對革蘭陽性菌，如葡萄球菌、化膿性鏈球菌、綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、糞鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、白喉?xiàng)U菌等有較強(qiáng)的抑制作用。對革蘭陰性菌，如淋球菌、螺旋桿菌、百日咳桿菌、布氏桿菌、軍團(tuán)菌、以及流感嗜血桿菌、擬桿菌也有相當(dāng)?shù)囊种谱饔谩ＥR床上主要用于治療呼吸道感染、皮膚與軟組織感染、胃腸道感染。適用于青霉素過敏者有紅霉素A\B\C\D95紅霉素的生產(chǎn)1.菌種紅色鏈霉菌：主要是紅霉素A2.發(fā)酵工藝96紅霉素的發(fā)酵工藝流程紅色鏈霉菌斜面孢子米孢子種子罐發(fā)酵罐發(fā)酵液發(fā)酵濾液真空冷凍干燥或液氮保藏孢子瓊脂斜面培養(yǎng)基37℃避光培養(yǎng)7~10d優(yōu)良孢子接種于大米或小米基質(zhì)37℃培養(yǎng)7~9d孢子懸浮液接種35℃通氣攪拌培養(yǎng)65h31℃

pH：6.6~7.2冷卻、沉淀、過濾補(bǔ)料：葡萄糖（每6H)氨水、丙酸消泡劑（豆油、菜油）繁殖罐孢子懸浮液接種33℃通氣攪拌培養(yǎng)40h97紅霉素的提取精制工藝發(fā)酵液濾洗液雜質(zhì)蛋白質(zhì)較多硫酸鋅ph7.2-7.8NaOH去除溶劑萃取法大孔樹脂吸附法效價(jià)不高丙酮結(jié)晶效價(jià)高收率高98四環(huán)素類抗生素

分子中含有四個(gè)并聯(lián)環(huán)對革蘭氏陽性菌、陰性菌（除銅綠假單胞菌）、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用，是一種廣譜抗菌素，對結(jié)核菌、變形菌等則無效。作用機(jī)制是與核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，從而抑制其蛋白質(zhì)合成。

1.長期使用易使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性2.副作用較多:四環(huán)素牙99四環(huán)類抗生素(tetracyclines)是四環(huán)素、土霉素、金霉素、地美環(huán)素、美他環(huán)素、多西環(huán)素(強(qiáng)力霉素)、米諾環(huán)素等天然和半合成抗生素的總稱。自40年代末這一類抗生素的第一個(gè)成員金霉素問世以來,由于它具有抗菌譜廣、毒性低、口服吸收良好以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn),很快成為繼青霉素之后的又一類最廣泛應(yīng)用的抗生素。除了主要用于人類的疾病醫(yī)療外,在畜牧業(yè)上還用于防治牲畜疾病和作為飼料添加劑促進(jìn)家禽家畜的生長。

品名分子結(jié)構(gòu)中文名英文名R2R5R6R6’R7金霉素chlortetracyclineHHOH-CH3Cl土霉素oxytetracyclineH