GMP質(zhì)量體系大腸桿菌檢查法

目的：建立大腸桿菌檢查法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，規(guī)范二大腸桿菌檢查法的操作范圍：適用于大腸桿菌檢查法職責(zé)：檢驗(yàn)科主管、檢驗(yàn)員規(guī)程：1簡(jiǎn)述大腸桿菌即大腸埃希菌（Escherichiacoli），為腸桿菌科埃希菌屬的模式種，埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃希菌等四個(gè)種。大腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸桿菌，表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染，即可能污染腸道病原體，大腸埃希菌除普通大腸桿菌外尚有致病性大腸桿菌，可引起嬰幼兒，成人爆發(fā)性腹瀉，為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸桿菌。用4-甲基傘形酮葡萄苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，即MUG）和靛基質(zhì)（Indole）試驗(yàn)檢查大腸桿菌是一項(xiàng)新技術(shù)，其檢驗(yàn)步聚為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌中分離單個(gè)菌，如MUG，Indole試驗(yàn)為陽(yáng)性或陰性即可報(bào)告結(jié)果，如MUG與Indole試驗(yàn)不一致時(shí)，則需分離培養(yǎng)，革蘭染色，鏡檢及生化試驗(yàn)鑒別。原理：利用目標(biāo)菌限定酶作用的底物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指示系統(tǒng)來(lái)鑒定目標(biāo)菌。實(shí)驗(yàn)證明96%的大腸桿菌含β－葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD），約10%的沙門(mén)菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，由于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強(qiáng)千萬(wàn)倍，易于觀察，沒(méi)有主觀性，因而用MUG鑒定大腸桿菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測(cè)。單一的MUG鑒別大腸桿菌其漏檢率達(dá)6%，鑒于98%的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性，故將MUG-靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)合，用EMB瓊脂平板分離，輔以IMViC試驗(yàn)，在理論上可使大腸桿菌的檢出率達(dá)99%。2儀器、設(shè)備及用具2.1無(wú)菌室［參照細(xì)菌，霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)2.1.1］。2.2凈化工作臺(tái).2.3恒溫培養(yǎng)箱(36±1℃)2.4高壓蒸汽滅菌器2.5 顯微鏡(1500×)2.6微波爐或其他適宜加熱裝置2.7水浴箱45±1℃2.8離心機(jī)(500～4000/min)2.9薄膜過(guò)濾裝置微孔濾膜直徑約50mm，孔徑0.45±0.02μm3.0電冰箱3.1勻漿儀3.2366nm紫外燈3.3玻璃器皿［參照細(xì)菌，霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)2.2.2］3試液指示液3.10.9%無(wú)菌氯化鈉溶液［附錄3.1］3.2無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2)［附錄3.3］3.3無(wú)菌對(duì)氨基苯甲酸溶液［附錄2.2］3.4無(wú)菌聚山梨酯80氯化鈉溶液［附錄3.2］3.5歐-波(Ehrlich-Boehme)試液［附錄2.17］3.6甲基紅試液［附錄4.2］3.7V-P試液 ［附錄2.11，2.13］3.8革蘭染色液［附錄2.4，2.10，2.16］3.9中性紅指示液［附錄4.1］3.10亞甲藍(lán)指示液［附錄4.3］3.11溴麝香草酚藍(lán)指示液［附錄4.6］3.12酸性品紅指示液［附錄4.7］3.13曙紅鈉指示液［附錄4.9］4培養(yǎng)基4.1營(yíng)養(yǎng)肉湯［附錄5.1］4.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂［附錄5.2］4.3膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基［附錄5.6］4.44-甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基［附錄5.7］4.5乳糖培養(yǎng)基，5%乳糖培養(yǎng)基［附錄5.21，5.22］4.6蛋白胨水培養(yǎng)基［附錄5.18］4.7磷酸鹽葡萄胨水培養(yǎng)基［附錄5.19］4.8枸櫞酸鹽培養(yǎng)基［附錄5.20］4.9曙紅亞甲藍(lán)(EMB)瓊脂［附錄5.8］4.10麥康凱瓊脂［附錄5.9］5對(duì)照用菌液取大腸桿菌［CMCC(B)44102］的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種到5ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)18～24H后，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至1:106，使對(duì)照菌液加入量含菌50～100個(gè)(一般用量為0.1ml)，其菌數(shù)在做陽(yáng)性對(duì)照的同時(shí)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。6準(zhǔn)備6.1供度品的檢驗(yàn)量［見(jiàn)細(xì)菌，霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)5.3］6.2供試液的制備6.2.1液體供試品［見(jiàn)細(xì)菌，霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)6.2.1］6.2.2固體，半固體或粘稠液供試品［見(jiàn)細(xì)菌，霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)6.2.2］6.2.3非水溶性供試品［見(jiàn)細(xì)菌，霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)6.2.3］6.2.4含抑菌成分供試品供度品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對(duì)照菌.不能檢出時(shí)，該供試液須按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后，依法檢查，同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。6.2.4.1稀釋法取規(guī)定量的供試液種入較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。6.2.4.2離心沉淀集菌法取規(guī)定量的供試液于無(wú)菌刻度離心管中，300r/min離心30min，移去上清液，留底部集菌液約2ml，并稀釋該供試液至原規(guī)定量.如有不溶性藥渣，可先以500r/min離心5min，取全部上層液，再按上述方法集菌處理。6.2.4.3薄膜過(guò)濾法，取規(guī)定量的供試液于稀釋劑100ml中，搖勻，以無(wú)菌操作加入裝有直徑約50mm，孔徑不大于0.45±0.02μm微孔濾膜的薄膜過(guò)濾器內(nèi)，過(guò)濾，用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100ml，將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng)基中。6.2.4.4中和法取規(guī)定量含磺胺類(lèi)的供試品，于100ml增菌液(含1%對(duì)氨基苯甲酸約1～5ml)中；含砷，汞類(lèi)的供試品，于硫乙醇酸培養(yǎng)基100ml中；含洗必泰供試品，于含適量聚出梨酯80等表面性劑的100ml增菌液中(表面活性劑的用量應(yīng)預(yù)試，用量過(guò)大有抑菌作用)。6.2.4.5沉降法取規(guī)定量供試液，自然沉降5min，取上層液于100ml增菌液中，本法適用于難溶于水的抗菌制劑。7操作步聚供試品質(zhì)7.1檢驗(yàn)程序供試品質(zhì)供試液MUG蛋白胨 供試液MUG蛋白胨BL增菌培養(yǎng)液BL增菌培養(yǎng)液EMB或麥康凱瓊脂平板EMB或麥康凱瓊脂平板 36±1℃ 18～24h36±1℃ 18～24h 疑似菌落純培養(yǎng)36±1℃ 5、24h疑似菌落純培養(yǎng) 36±1℃18～24h地區(qū)性MUG陰性，靛基質(zhì)陽(yáng)性；MMUG陰性，靛基質(zhì)陽(yáng)性；MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陰性；MUG陰性，靛基質(zhì)陽(yáng)性；革蘭染色，乳糖，靛基質(zhì)、甲基紅、V-P、枸櫞酸鹽利用革蘭染色，乳糖，靛基質(zhì)、甲基紅、V-P、枸櫞酸鹽利用報(bào)告 18～24h

36±1℃24～48h報(bào)告7.2增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基3瓶，每瓶各100ml.2瓶分別加入規(guī)定量的供試液，其中1瓶加入對(duì)照菌50～100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照.37℃培養(yǎng)18～24h(必要時(shí)可延至48h)。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。搖勻上述BL增菌培養(yǎng)液，以滅菌吸管取供試品膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液，供試品陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)液，陰性對(duì)照培養(yǎng)液各0.2ml分別加入MUG一蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)基5.7)管，37℃培養(yǎng)4、24h后，將各管置366nm紫外燈下觀察有無(wú)藍(lán)白色熒光，然后加歐一波試液4～5滴于上MUG管內(nèi)，觀察液面顏色.MUG陽(yáng)性(有熒光)，靛基質(zhì)陽(yáng)性(玫瑰紅色)，報(bào)告檢出大腸桿菌；MUG陰性(無(wú)熒光)，靛基質(zhì)陰性(無(wú)色)，報(bào)告未檢出大腸桿菌。7.3分離培養(yǎng)如MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陰性或MUG陰性，靛基質(zhì)陽(yáng)性時(shí)，將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18～24h，觀察EMB或麥康凱瓊脂平板有無(wú)可疑大腸桿菌菌落生長(zhǎng)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板呈典型菌落生長(zhǎng)時(shí)，供試品分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落但不同于表1所列特征，可判為供試品1g或1ml未檢出大腸桿菌。表1大腸桿菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)典型菌落呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，有金屬光澤.非典型菌落呈淺紫色，粉紅色，或菌落中心紫色或無(wú)明顯暗色中心，無(wú)金屬光澤.麥康凱瓊脂典型菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn).非典型菌落呈微紅色，或菌落中心呈紅色.當(dāng)陽(yáng)性菌對(duì)照平板未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落經(jīng)檢查不是大腸桿菌，應(yīng)研究原因，重新試驗(yàn)或重新制備供試液，以消除供度品抑菌成分的影響.有疑似菌落生長(zhǎng)者，挑取可疑菌落做革蘭染色，鏡檢、IMViC試驗(yàn)。7.4純培養(yǎng)如生長(zhǎng)菌落與表1所弄特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2～3個(gè)以上疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24h，作以下檢查。如平板上無(wú)單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)(紫黑色，或有金屬光澤)，應(yīng)沾取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18～24h，再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。7.5革蘭染色，鏡檢7.5.1以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈玻上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過(guò)火焰2～3次(載玻片不燙手)固定。7.5.2滴加結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。7.5.3滴加碘液，媒染1min，水洗，以濾紙吸干余水。7.5.4滴加95%乙醇，脫色20～30s，水洗。7.5.5滴加沙黃液，復(fù)染1min，待干后，鏡檢。7.5.6染色結(jié)果革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭陰性菌呈紅色，大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。7.5.7注意事項(xiàng)7.5.7.1玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌不可濃，否則，菌細(xì)胞成堆或連成片，染色反應(yīng)難于判斷，菌細(xì)胞形態(tài)難于觀察。7.5.7.2培養(yǎng)物的菌齡以16～24h為宜.培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的革蘭陽(yáng)性菌易染成紅色。7.5.7.3脫色是關(guān)鍵，脫色時(shí)間不足菌細(xì)胞易染成陽(yáng)性，脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易染成陰性。8生化試驗(yàn)8.1乳糖發(fā)酵試驗(yàn)，取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24～48h，觀察產(chǎn)酸(指示劑為酸性品紅者為紅色；指示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色)，產(chǎn)氣(小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無(wú)論大小)。為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種5%乳糖發(fā)酵管.絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌.可于24h出現(xiàn)陽(yáng)性.或適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。8.2靛基質(zhì)試驗(yàn)(I)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48h，沿管壁加入歐一波試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液面呈玫瑰色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。98%的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性.一般24h即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，以無(wú)菌操作規(guī)程先從管中取出1或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)是陰性，作下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24h，作靛基質(zhì)試驗(yàn)。8.3甲基紅試驗(yàn)(M)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于培養(yǎng)液加入甲基紅指示液2～3滴(約每ml培養(yǎng)液加指示液1滴)，輕輕搖動(dòng)，立即觀察，呈鮮紅色桔紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。８.4乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)(V-P)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于2ml培養(yǎng)液中加入a-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀試液0.4ml，充分振搖，在4h(通常在30min)內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽(yáng)性，無(wú)紅色反應(yīng)為陰性。8.5枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)2～4天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)改變，無(wú)菌苔生長(zhǎng)為陰性。9結(jié)果判斷9.1當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)MUG呈陽(yáng)性，供試品MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陽(yáng)性，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌。MUG陰性，靛基質(zhì)陽(yáng)性，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸桿菌。9.2MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陰性，IMViC試驗(yàn)為一十一一，革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陽(yáng)性，IMViC試驗(yàn)為十十一一，革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌。供試品培養(yǎng)物檢查不符合9.2二項(xiàng)中的任一項(xiàng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸桿菌。當(dāng)陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)或陽(yáng)性對(duì)照未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落不是大腸桿菌，不能作出檢驗(yàn)報(bào)告。10注意事項(xiàng)10.1MUG法不必從混合菌中分離單個(gè)菌落，除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬，沙門(mén)菌屬的菌株，以及少數(shù)革蘭陽(yáng)性球菌，桿菌和芽孢菌，其MUG為陽(yáng)性.因此，在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽(yáng)性菌的干擾，至于志賀菌，沙門(mén)菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長(zhǎng)，即使有生長(zhǎng)，本法能檢出.既然藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌，沙門(mén)菌。10.2配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正pH值，滅菌后PH不得過(guò)7.4，否則pH值偏高，MUG分解，本身則顯熒光.分裝MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管、