食品中金黃葡萄球菌及其檢驗(yàn)課件

第七章食品中致病球菌的檢驗(yàn)

第一節(jié)金黃葡萄球菌及其檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌及其檢驗(yàn)

金黃色葡萄球菌屬于微球菌科葡萄球菌屬,金黃色葡萄球菌是該屬中的一個(gè)種.引起人類疾病的葡萄球菌主要是金黃色葡萄球菌,除可引起皮膚組織炎癥外,還可產(chǎn)生腸毒素.如果該菌在食品中大量生長(zhǎng)繁殖,產(chǎn)生毒素,人誤食了含有毒素的食品,就會(huì)發(fā)生食物中毒,因此,由該菌引起的中毒為毒素型食物中毒.食品中存在金黃色葡萄球菌對(duì)人的健康是一種潛在威脅,所以檢驗(yàn)食品中的金黃葡萄球菌及數(shù)量具有實(shí)際意義.主要內(nèi)容一、金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)

1、形態(tài)與染色：(staphylococcusaureus)典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜。革蘭氏染色陽(yáng)性。典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8mm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。葡萄球菌革蘭染色鏡下圖金黃色葡萄球菌的掃描電鏡照片2.分型簡(jiǎn)介血清學(xué)分型：金黃色葡萄球菌水解，獲得兩種抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原蛋白抗原主要為葡萄球菌A蛋白（SPA)，是一種表面抗原，90%以上金黃色葡萄球菌有此抗原，無特異性。多糖抗原為半抗原，有型特異性。噬菌體分型根據(jù)腸毒素分型根據(jù)血漿凝固酶分型3、培養(yǎng)特性金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度37°C,最適生長(zhǎng)pH7.4。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10-15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)。在肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，37℃,培養(yǎng)后24h,呈均勻渾濁生長(zhǎng),延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,管底出現(xiàn)少量沉淀,輕輕振搖,沉淀物上升,旋即消散,培養(yǎng)2-3d后可形成很薄的菌環(huán),在管底則形成多量粘稠沉淀。3、培養(yǎng)特性葡萄球菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)24-48h后,可形成圓形凸起、邊沿整齊、表面光滑、濕潤(rùn)、有光澤、不透明的菌落，直徑1-2mm?？僧a(chǎn)生不同的色素。如金黃、檸檬，色素為脂溶性，不溶于水，故色素只限于培養(yǎng)物，而不外滲至培養(yǎng)基中。金黃色葡萄球菌在血平板上形成的菌落較大，多數(shù)致病菌株可產(chǎn)生溶血毒素，菌落周圍形成透明的溶血圈(β溶血圈)，非致病性球菌則無此現(xiàn)象。4.生化特性葡萄球菌大多數(shù)菌株可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。致病菌株多，能分解甘露醇產(chǎn)酸。甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，VP反應(yīng)弱陽(yáng)性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素產(chǎn)氨，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)磺胺類藥物敏感性低，但對(duì)青霉素、紅霉素等高度敏感。金黃色葡萄球菌在甘露醇鹽平板上的菌落

金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。產(chǎn)生的毒素和酶主要有下列幾種：（1）溶血毒素：外毒素，可使動(dòng)物紅細(xì)胞溶解，培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)溶血環(huán)。按抗原性不同，至少有α、β、γ、δ、ε五種，對(duì)人類致病作用的主要是α溶血素。α溶血素是一種外毒素，具有良好的抗原性。經(jīng)甲醛處理可制成類毒素。5.毒素與酶（3）腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C1、C2、D、E及F六種血清型。該毒素為一種可溶性蛋白質(zhì)，耐熱，100℃30分鐘不破壞。腸毒素可引起急性胃腸炎即食物中毒，以A型引起的食物中毒最多。5.毒素與酶5.毒素與酶（4）血漿凝固酶：血液凝固的本質(zhì)是血漿內(nèi)的可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗芙獾睦w維蛋白.正常人體在鈣離子的參與下凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?在血液中加入枸櫞酸鈉,可與血漿中的鈣離子結(jié)合成不解離的枸櫞酸鈣,凝血酶不能形成,血凝的化學(xué)反應(yīng)不能進(jìn)行.血漿凝固酶是能使含有枸椽酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔血漿發(fā)生凝固的酶類物質(zhì)，致病菌株多能產(chǎn)生，如金黃葡萄球菌。常作為鑒別葡萄球菌有無致病性的重要標(biāo)志。當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。同時(shí)，凝固酶集聚在菌體四周，亦能保護(hù)病菌不受血清中殺菌物質(zhì)的作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān)。（5）溶纖維蛋白酶可使人及家兔、犬的已凝固的纖維蛋白溶解。溶纖維蛋白酶是一種激酶，可激活血漿蛋白酶原成為血漿蛋白酶而使纖維蛋白溶解。初次培養(yǎng)后，菌落周圍若出現(xiàn)一個(gè)不透明圈，表示產(chǎn)生凝固酶；繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，不透明圈消失，說明是溶纖維蛋白酶作用的結(jié)果。（6）透明質(zhì)酸酶透明質(zhì)酸酶具有高度的粘稠性，是機(jī)體結(jié)締組織中基質(zhì)的主要成分。它被透明質(zhì)酸酶水解后，結(jié)締組織細(xì)胞間失去粘性呈疏松狀態(tài)，有利于細(xì)菌和毒素在機(jī)體內(nèi)擴(kuò)散，因此透明質(zhì)酸酶又稱為擴(kuò)散因子。5.毒素與酶6.抵抗力

金黃色葡萄球菌對(duì)熱和干燥的抵抗力較一般無芽胞細(xì)菌強(qiáng)，加熱80℃30分鐘才被殺死。在干燥的膿汁、痰液中可存活2-3月。5%石炭酸中10-15分鐘死亡。對(duì)堿性染料敏感，十萬(wàn)分之一的龍膽紫液即可抑制其生長(zhǎng)。對(duì)青霉素、紅霉素和慶大霉素高度敏感，但易產(chǎn)生耐藥性。

7.葡萄球菌的致病性（1）引起的主要疾病

化膿性感染：如毛囊炎、癤、癰、傷口化膿、氣管炎、肺炎、中耳炎、腦膜炎、心包炎等；

全身感染：如敗血癥、膿毒血癥等

食物中毒

金黃色葡萄球菌引起的下顎感染金黃色葡萄球菌引起的須瘡感染7.葡萄球菌的致病性（3）流行病學(xué)特點(diǎn)a.發(fā)病率高近年來，美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。b.季節(jié)分布

多見于春夏季。7.葡萄球菌的致病性（3）流行病學(xué)特點(diǎn)C.中毒食品種類多如奶、肉、蛋、魚及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道。d.污染食品途徑：食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌，造成食品污染；食品在加工前本身帶菌，或在加工過程中受到了污染，產(chǎn)生了腸毒素，引起食物中毒；熟食制品包裝不嚴(yán)，運(yùn)輸過程受到污染；奶?；蓟撔匀橄傺谆蚯菪缶植炕摃r(shí)，對(duì)肉體其他部位的污染。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位常成為污染源。二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)

方法：增菌培養(yǎng)法、直接計(jì)算法(一)檢驗(yàn)原理:金黃葡萄球菌耐鹽性強(qiáng)，在100-150g/L氯化鈉培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)的鹽濃度為5-7.5%，可以利用這個(gè)特性對(duì)金黃葡萄球菌增菌，抑制雜菌。金黃葡萄球菌可產(chǎn)生溶血素，在血平板上生長(zhǎng)，菌落周圍有透明的溶血環(huán)；可產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵磷脂產(chǎn)生甘油脂和可溶性磷酸膽堿，所以在baird-parker(含卵黃和亞碲酸鉀)平板上生長(zhǎng)，菌落為黑色，周圍有一渾濁帶,在其外層有一透明圈，利用此特性可分離金黃葡萄球菌；金黃葡萄球還可產(chǎn)生凝固酶，酶可使血漿中的可溶性纖維蛋白原變成不溶解的纖維蛋白，使血漿凝固，這是鑒定致病性金黃葡萄球菌的重要指標(biāo)，是否是致病的金黃葡萄球菌主要看它是否產(chǎn)生凝固酶。二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)

增菌培養(yǎng)法(二)檢驗(yàn)程序

金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序如圖檢樣→稀釋→7.5%NaCl肉湯增菌培養(yǎng)→血平板、B—P分離→鏡檢、血漿凝固E試驗(yàn)→報(bào)告結(jié)果

二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)

(三)操作步驟

1、檢樣處理

稱取25g固體樣品；吸取25mL液體樣品，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。

2、增菌

吸取5mL上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨豆肉湯50mL培養(yǎng)基內(nèi)，置36±1℃溫箱培養(yǎng)24h。在肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，在胰酪陳大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)3、平板分離血平板：菌落成金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有透明溶血圈（β型）

二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)B—P平板：

主要成分及作用：氯化鋰、甘氨酸:抑制非制病性葡萄球的生長(zhǎng)丙酮酸鈉:促進(jìn)葡萄球菌生長(zhǎng)亞碲酸鉀:抑制G-桿菌生長(zhǎng)，可被金黃色葡萄球菌還原為碲鹽呈黑色卵黃:含蛋白質(zhì)、卵磷、脂肪二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)Baird－Parker平板，36±1℃培養(yǎng)24h。

圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑為2-3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度。金黃葡萄球菌在Baird－Parker平板上的菌落形態(tài)二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)4、鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)挑取金黃色葡萄球菌可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列是葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.5-1μm。二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)如發(fā)現(xiàn)葡萄球菌,再做血漿凝固E試驗(yàn)

吸取1∶4新鮮兔血漿0.5mL，放入于8mm×100mm試管內(nèi)，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL，振蕩搖勻，放36±1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以已知陽(yáng)性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)

直接計(jì)數(shù)方法

吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行十倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入三塊Baird－Parker平板，每個(gè)平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個(gè)平板。如水分不多吸收，可將平板放在36±1℃溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36±1℃溫箱培養(yǎng)。

四、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選5個(gè)菌落，分別接種血平板，36±1℃24h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。

二、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告（1）初步報(bào)告：根據(jù)血平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)和鏡檢，如發(fā)現(xiàn)有G+葡萄串狀球菌存在，且有溶血性，則初步報(bào)告為：“有金黃色葡萄球菌存在，1g樣品約含多少?！保?）結(jié)果報(bào)告：根據(jù)培養(yǎng)特性、鏡檢、生化試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)