分子醫(yī)學(xué)技能實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)六 蛋白質(zhì)離子交換層析,蛋白質(zhì)紫外

實(shí)驗(yàn)六·蛋白質(zhì)技術(shù)1.離子交換層析濃縮蛋白質(zhì)溶液2.紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度1.離子交換層析濃縮蛋白質(zhì)溶液基本概念

層析法是一種基于被分離物質(zhì)理化和生物學(xué)特性的不同（吸附力、分子量、電荷性質(zhì)、溶解度、親和力），使其在某種介質(zhì)中移動(dòng)的速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法?！苡腥~綠素的乙醚碳酸鈣粉末黃色的色帶（葉黃素）綠色的色帶（β-胡蘿卜素）繼續(xù)洗脫，分段收集，就可以使葉黃素和β-胡蘿卜素分離一個(gè)經(jīng)典的層析實(shí)驗(yàn)——葉綠素的層析分離色譜法層析的基本構(gòu)成固定相——是層析的一個(gè)基質(zhì)固體（吸附劑、凝膠、離子交換劑）

液體（固定在硅膠或纖維素上的溶液，如氣液色譜、液液色譜等。）能與待分離物進(jìn)行可逆的吸附、溶解、交換等作用阻力：阻止所分離的樣品向前移動(dòng)流動(dòng)相推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界體等。

洗脫時(shí)所用的溶劑，也叫洗脫液。動(dòng)力：不斷地前移，并帶動(dòng)所分離的樣品向前移動(dòng)，如電壓、吸附能力、氣壓等。分配系數(shù)（K）在一定條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中濃度的比值被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)、層析柱的溫度洗脫用洗脫液沖洗層析柱，使樣品中不同組分得以分離的過程。洗脫曲線以洗脫的體積為橫坐標(biāo)，組分的濃度為縱坐標(biāo)作圖所得的曲線下面積。(二)層析法分類1.根據(jù)分離原理：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析。2.根據(jù)流動(dòng)相不同：液相層析（液-液層析，液-固層析）、氣相層析（氣-液層析，氣-固層析）3.根據(jù)支持物方式：柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析離子交換層析根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離固定相：離子交換劑——人工交聯(lián)的帶有能解離基團(tuán)的有機(jī)高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠離子交換層析柱常用的陽(yáng)離子交換纖維素（本身陰離子）有:

磺酸甲基纖維素(SMC)

羧甲基纖維素(CMC)

磷酸基纖維素(PC)常用的陰離子交換纖維素（本身陽(yáng)離子）有:

二乙基胺乙基纖維素(DEAEC)

三乙基胺乙基纖維素(TEAEC)離子交換層析基本原理123451.平衡階段:離子交換劑緩沖液中的相反電荷離子（平衡離子）結(jié)合2.吸附階段：樣品與平衡離子進(jìn)行交換3、解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)4.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用平衡液中的

反離子樣品溶液洗脫液

（梯度濃度）

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)一般低于8，在pH為8的弱離子強(qiáng)度溶液帶負(fù)電荷，可以被陰離子交換樹脂吸附。當(dāng)增加緩沖液離子強(qiáng)度或陰離子電負(fù)性時(shí)，可以將蛋白質(zhì)成批量洗脫下來(lái)，達(dá)到蛋白質(zhì)濃縮的目的。以用陽(yáng)離子交換劑分離蛋白質(zhì)為例，在一定的pH

條件下，等電點(diǎn)pI<

pH的蛋白帶負(fù)電，不能與陽(yáng)離子交換劑結(jié)合；等電點(diǎn)pI

>

pH的蛋白帶正電，能與陽(yáng)離子交換劑結(jié)合，一般pI

越大的蛋白與離子交換劑結(jié)合力越強(qiáng)。但由于生物樣品的復(fù)雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結(jié)合情況較難估計(jì)，往往要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。試劑:今天實(shí)驗(yàn)1：濃縮蛋白樣品：低濃度蛋白質(zhì)溶液陰離子交換樹脂纖維素DE-52（DEAECelluloseDE-52

）

預(yù)溶脹微粒,為中等堿性陰離子交換劑

上樣緩沖液低離子強(qiáng)度緩沖液：

0.02M磷酸緩沖液

-0.02MNaCl（

pH8.0）PI<8.0的蛋白可以被吸附？洗脫緩沖液低到高離子強(qiáng)度緩沖液：

0.02M磷酸緩沖液-----1MNaCl（pH8.0）實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)⑴預(yù)裝層析柱（注意：不要干柱）⑵柱的平衡用1個(gè)柱體積的上樣緩沖液過柱⑶濃縮前蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定取待濃縮的蛋白質(zhì)溶液在752型分光光度計(jì)上測(cè)定蛋白質(zhì)的OD280和OD260值⑷上樣

加入低濃度蛋白質(zhì)溶液（保護(hù)膠面,讓樣品全部進(jìn)入樹脂中。⑸平衡（洗雜質(zhì)）用2個(gè)柱體積的上樣緩沖液流過柱子。⑹洗脫

用1個(gè)柱體積洗脫緩沖液過柱，回收蛋白。（收集5-10管，每管3ml）⑺測(cè)定蛋白濃度在收集的過程中測(cè)定每管溶液的OD280和OD260讀數(shù)，選取濃度最高管為濃縮蛋白——蛋白質(zhì)含量的測(cè)定2.紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理原理：酪氨酸、色氨酸的苯環(huán)共軛雙鍵，OD280最大吸收峰優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、樣品可以回收缺點(diǎn)：有一定的誤差（酪氨酸、色氨酸含量差異）受核酸類物質(zhì)干擾注意：在紫外光下檢測(cè)，使用石英杯實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果分析

在280nm和260nm兩處波長(zhǎng)分別測(cè)得光密度值、再按下列公式計(jì)算。1、OD280／OD260＜1.5時(shí)，用Lowry-Kalokar公式：

樣本蛋白質(zhì)含量(mg／m1)

＝1.5×OD280－0.75×OD2602、OD280／OD260﹥1.5時(shí)，用Lamber-Beer定律計(jì)算：

樣本蛋白質(zhì)含量(mg／m1)

=

OD280／