熒光探針簡(jiǎn)介

生物體中的金屬元素Na、K維持細(xì)胞兩側(cè)滲透壓、形成神經(jīng)沖動(dòng)；Ca抑制腦神經(jīng)的異常興奮，使人保持鎮(zhèn)靜；Zn對(duì)大腦的記憶與思維過(guò)程有重要影響；第1頁(yè)/共36頁(yè)第一頁(yè)，共37頁(yè)。金屬蛋白(1)含鐵蛋白。如血紅蛋白、細(xì)胞色素C等，前者具有載氧、釋氧功能，細(xì)胞色素C是電子傳遞體。(2)

含銅蛋白。如血漿藍(lán)銅蛋白和質(zhì)藍(lán)體，前者參與機(jī)體內(nèi)銅的調(diào)節(jié)，后者是生物過(guò)程中的電子傳遞體。(3)鐵硫蛋白。是一類含鐵、硫的天然原子簇化合物與蛋白質(zhì)鏈上半胱氨酸結(jié)合的金屬蛋白，如細(xì)菌鐵氧還蛋白含F(xiàn)e4S4原子簇，它是生物體中重要電子傳遞體。(4)金屬酶。具有催化生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的金屬蛋白，常常金屬離子位于活性中心，如鋅酶。第2頁(yè)/共36頁(yè)第二頁(yè)，共37頁(yè)。20世紀(jì)60年代以來(lái)，隨著配位化學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)等多個(gè)學(xué)科的發(fā)展，出現(xiàn)了一門新的交叉學(xué)科——生物無(wú)機(jī)化學(xué)。其研究對(duì)象是生物體內(nèi)的金屬（和少數(shù)非金屬）元素及其化合物，特別是痕量金屬元素和生物大分子配體形成的生物配合物，如各種金屬酶、金屬蛋白等。側(cè)重研究它們的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-生物活性之間的關(guān)系以及在生命環(huán)境內(nèi)參與反應(yīng)的機(jī)理。第3頁(yè)/共36頁(yè)第三頁(yè)，共37頁(yè)。生物體中參與代謝過(guò)程的金屬離子，往往以游離態(tài)和配合物的形式存在；因此，其金屬離子的濃度及其分布情況就成為十分關(guān)鍵的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。第4頁(yè)/共36頁(yè)第四頁(yè)，共37頁(yè)。如何檢測(cè)生物體內(nèi)離子的濃度和分布？例如，細(xì)胞內(nèi)Ca2+等的檢測(cè)：1）核磁共振波譜法；2）化學(xué)修飾電極（電化學(xué)探針）；3）發(fā)光蛋白法；4）熒光探針?lè)椒ǎㄗ畛Ｓ茫?。引自：科學(xué)技術(shù)與工程，2004，4（11），948~953第5頁(yè)/共36頁(yè)第五頁(yè)，共37頁(yè)。熒光探針?lè)?/p>

利用某種能與特定目標(biāo)分子或離子特異性結(jié)合，且復(fù)合后熒光光譜發(fā)生顯著變化的探針?lè)肿?，?duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行染色，然后在紫外光照射下發(fā)射熒光，從而通過(guò)顯微鏡直接觀察和測(cè)量得到金屬離子濃度和分布等信息的方法。第6頁(yè)/共36頁(yè)第六頁(yè)，共37頁(yè)。配體與Ca2+絡(luò)合后，熒光顯著增強(qiáng)引自：第7頁(yè)/共36頁(yè)第七頁(yè)，共37頁(yè)。熒光探針?lè)椒ǖ膬?yōu)點(diǎn)靈敏度高（一般用量10-4~10-5mol/L）；選擇性好；可用顯微鏡直接觀察，時(shí)空分辨率很高；響應(yīng)時(shí)間短；操作方便、成本低；??????第8頁(yè)/共36頁(yè)第八頁(yè)，共37頁(yè)。測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞中的Ca2+引自：第9頁(yè)/共36頁(yè)第九頁(yè)，共37頁(yè)。怎樣設(shè)計(jì)熒光探針？基本要點(diǎn)：熒光探針?lè)肿佑勺R(shí)別基團(tuán)和熒光團(tuán)兩部分鍵合而成；依據(jù)一定的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，使探針?lè)肿优c目標(biāo)物結(jié)合前后的熒光光譜有顯著區(qū)別。第10頁(yè)/共36頁(yè)第十頁(yè)，共37頁(yè)。識(shí)別基團(tuán)螯合劑類超分子配體第11頁(yè)/共36頁(yè)第十一頁(yè)，共37頁(yè)。熒光團(tuán)熒光增強(qiáng)：1、分子中含有較大的共軛體系；2、分子結(jié)構(gòu)較好的平面性和剛性；3、含有與共軛體系直接相連的供電子基團(tuán)。熒光減弱：1、僅含與共軛體系直接相連的吸電子基團(tuán)；2、含有可導(dǎo)致熒光猝滅的基團(tuán)。第12頁(yè)/共36頁(yè)第十二頁(yè)，共37頁(yè)。如何使探針與客體結(jié)合前后發(fā)生熒光光譜的顯著變化？1）光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理（PET）；2）光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理（PCT）；3）熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理（FRET）；4）基于其它原理的設(shè)計(jì)。第13頁(yè)/共36頁(yè)第十三頁(yè)，共37頁(yè)。光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理（PET）第14頁(yè)/共36頁(yè)第十四頁(yè)，共37頁(yè)。熒光探針與Ca2+結(jié)合后熒光增強(qiáng)引自：第15頁(yè)/共36頁(yè)第十五頁(yè)，共37頁(yè)。與結(jié)合后，電子供體的HOMO能級(jí)下降，從而供電子能力降低。熒光猝滅消失。電子供體的基態(tài)能級(jí)高度處于熒光團(tuán)的HOMO和LUMO之間。從而，熒光團(tuán)被激發(fā)后，供體電子轉(zhuǎn)移到熒光團(tuán)的HOMO軌道上，使LUMO軌道上的電子無(wú)法通過(guò)輻射馳豫回到基態(tài)，從而使熒光猝滅。與Ca2+結(jié)合前發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET），無(wú)熒光發(fā)射。正常發(fā)出熒光注意分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：熒光團(tuán)與猝滅基團(tuán)之間一般以非共軛基團(tuán)相連。第16頁(yè)/共36頁(yè)第十六頁(yè)，共37頁(yè)。光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理（PCT）第17頁(yè)/共36頁(yè)第十七頁(yè)，共37頁(yè)。識(shí)別基團(tuán)與Zn2+結(jié)合后，造成與稠雜環(huán)相連的N原子的供電子能力下降，減弱了光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移，從而熒光強(qiáng)度降低，熒光光譜藍(lán)移。當(dāng)直接連有供電子基的熒光團(tuán)和吸電子基共扼連接時(shí)，在光的激發(fā)下，分子內(nèi)就會(huì)發(fā)生從電子供體到電子受體的電荷轉(zhuǎn)移。此即光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移（PCT）。PCT效應(yīng)可以使分子的熒光增強(qiáng)并且光譜紅移。引自：第18頁(yè)/共36頁(yè)第十八頁(yè)，共37頁(yè)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理（FRET）第19頁(yè)/共36頁(yè)第十九頁(yè)，共37頁(yè)。以485nm做激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，加入Zn2+前，該分子在518nm附近顯示熒光素基團(tuán)的特征發(fā)射；而當(dāng)加入Zn2+后，發(fā)射峰紅移至羅丹明基團(tuán)的特征發(fā)射峰（590nm）。引自：Anal.Chem.,2010,82,3108第20頁(yè)/共36頁(yè)第二十頁(yè)，共37頁(yè)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（PRET）是指在兩個(gè)不同的熒光團(tuán)中，如果一個(gè)熒光團(tuán)(供體)的發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光團(tuán)(受體)的吸收光譜有一定的重疊，則當(dāng)這兩個(gè)熒光團(tuán)間的距離較近時(shí)(一般小于10nm)，就可以觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即用供體的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，可觀察到受體的熒光發(fā)射。Zn2+的引入加強(qiáng)了供體與受體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致了熒光光譜的變化。光合作用中能量在葉綠素分子間傳遞第21頁(yè)/共36頁(yè)第二十一頁(yè)，共37頁(yè)?；谄渌淼臒晒馓结樷c離子與大環(huán)結(jié)合后限制了分子的構(gòu)象異構(gòu)，使分子結(jié)構(gòu)具有了更好的剛性和平面性，從而增強(qiáng)了熒光。引自：第22頁(yè)/共36頁(yè)第二十二頁(yè)，共37頁(yè)。單光子熒光探針的缺點(diǎn)1、背景干擾較強(qiáng)生物體中的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的殘基以及某些輔酶也能夠被紫外光激發(fā)并發(fā)出熒光，從而產(chǎn)生背景干擾。2、對(duì)生物體的光損傷較大紫外光損傷細(xì)胞；非輻射馳豫導(dǎo)致自由基（主要是單線態(tài)氧）生成。3、紫外光穿透能力低易被細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)吸收。第23頁(yè)/共36頁(yè)第二十三頁(yè)，共37頁(yè)。雙光子熒光（TPEF）探針雙光子熒光（TPEF）在高強(qiáng)度的激光作用下，分子通過(guò)一個(gè)虛中間態(tài)（壽命約10-16s）同時(shí)吸收兩個(gè)光子達(dá)到激發(fā)態(tài)，然后經(jīng)輻射馳豫發(fā)出熒光，回到基態(tài)的過(guò)程。第24頁(yè)/共36頁(yè)第二十四頁(yè)，共37頁(yè)。由于同時(shí)吸收兩個(gè)光子，在熒光量子產(chǎn)率一定的條件下，雙光子熒光的強(qiáng)度正比于激光強(qiáng)度的二次方。一個(gè)物質(zhì)的雙光子吸收能力用雙光子吸收截面（σ2）表示，一個(gè)物質(zhì)的雙光子吸收截面越大，其雙光子吸收能力越強(qiáng)。σ2單位用GM表示。第25頁(yè)/共36頁(yè)第二十五頁(yè)，共37頁(yè)。哪些分子具有較強(qiáng)的雙光子吸收能力？1、含有供電子基團(tuán)（D）和/或吸電子基團(tuán)（A），且均通過(guò)大的π體系以共軛方式相連；2、具有以下結(jié)構(gòu)特征：1）D-π-D2）D-π-A3）D-π-A-π-D4）A-π-A5）A-π-D-π-A6）A（-π-D）3第26頁(yè)/共36頁(yè)第二十六頁(yè)，共37頁(yè)。3、增強(qiáng)供/吸電子基團(tuán)的供/吸電子能力或增加供/吸電子基團(tuán)的數(shù)目，一般有利于增強(qiáng)雙光子吸收能力；有關(guān)構(gòu)效關(guān)系的其它內(nèi)容，請(qǐng)看：第27頁(yè)/共36頁(yè)第二十七頁(yè)，共37頁(yè)。鎂離子被大環(huán)螯合后，使與共軛體系相連的N原子的供電子能力下降，從而使雙光子吸收截面顯著下降。與鎂離子結(jié)合后，熒光量子產(chǎn)率并沒(méi)有明顯下降，但雙光子吸收截面明顯下降，故而熒光勢(shì)必減弱。引自：第28頁(yè)/共36頁(yè)第二十八頁(yè)，共37頁(yè)。光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）機(jī)理引自：第29頁(yè)/共36頁(yè)第二十九頁(yè)，共37頁(yè)。雙光子熒光探針的優(yōu)點(diǎn)：1、生物分子的雙光子吸收截面大都很小，故而不會(huì)產(chǎn)生背景熒光，從而背景干擾很??；2、長(zhǎng)波激發(fā)，短波發(fā)射，故而穿透能力很強(qiáng)，且對(duì)生物體的光損傷較??；3、使用激光聚焦激發(fā)，發(fā)生熒光的區(qū)域大小僅為λ3，從而可以達(dá)到很高的空間分辨率。第30頁(yè)/共36頁(yè)第三十頁(yè)，共37頁(yè)。熒光探針的制備采取有機(jī)合成方法第31頁(yè)/共36頁(yè)第三十一頁(yè)，共37頁(yè)。熒光探針的產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)量小(全球只需要幾公斤)；附加值高(約100美元/mg)；投資小(生產(chǎn)車間僅幾百平米，通過(guò)有機(jī)合成進(jìn)行生產(chǎn))；技術(shù)含量高（小批量生產(chǎn)銷售，需要較少的高素質(zhì)研發(fā)、有機(jī)合成人員和大批具備專業(yè)背景的銷售人員）。引自：上海染料，2009，37（5），39~50第32頁(yè)/共36頁(yè)第三十二頁(yè)，共37頁(yè)。國(guó)內(nèi)進(jìn)行相關(guān)研究的大學(xué)和研究所（部分）中科院（化學(xué)研究所、感光化學(xué)研究所、理化技術(shù)研究所等等）；高校：中南大學(xué)、蘭州大學(xué)、山東大學(xué)、武漢大學(xué)、吉林大學(xué)、南京大學(xué)、華東理工大學(xué)、大連理工大學(xué)、中山大學(xué)、南京師范大學(xué)、山東師范大學(xué)、湖南大學(xué)等等。第33頁(yè)/共36頁(yè)第三十三頁(yè)，共37頁(yè)。國(guó)外權(quán)威期刊Chem.Commun.Org.Lett.第34頁(yè)/共36頁(yè)第三十四頁(yè)，共37頁(yè)。ThankyouallforcomingYouweregreataudience第35頁(yè)/共36頁(yè)第三十五頁(yè)，共37頁(yè)。感謝您的觀看！第36頁(yè)/共36頁(yè)第三十六頁(yè)，共37頁(yè)。內(nèi)