第三部分基因組和測序原理

人類基因組計劃HumanGenomeProject第一頁，共五十九頁。TheHumanGenome23chromosomes3,2x109basepairs(3,200,000,000)<5%mRNA(30,000genes)<3%translatedintoprotein>90%unknownfunctionExon1Exon2Etein-codingregion............gene第二頁，共五十九頁。Strategies:randomshotgun(HUGO)wholegenomeshotgun(Celera)第三頁，共五十九頁。RandomShotgun:Genomiclibraryproductionwholegenome:3,200,000kbpartiallydigestedDNA:sizing:100-500kbBAClibrariesAdaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenterMappingpieces:100-500kb第四頁，共五十九頁。MappingMARKERSMARKERS:sequencetaggedsites(STS)restrictionsitepatternknowngenes...第五頁，共五十九頁。MappingofBAC/YACClones第六頁，共五十九頁。mappedBACclone:100-500kbshearedDNA:1.0-2.0kbsequencingtemplates:randomreads(0.6-1kb)Adaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenterRandomShotgun:Sequencing(randomphase)第七頁，共五十九頁。Celera:WholeGenomeShotgunSequencingwholegenome:3,200,000kbshearedDNA:1.0-2.0kbsequencingtemplatesAdaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenterrandomreads(0.6-1kb)第八頁，共五十九頁。ShotgunSequencing:Assembly(both)=Consensus(sequence)gaplowbasequalitysinglestrandedregionmis-assembly(inverted)Adaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenter?draftquality“第九頁，共五十九頁。ShotgunSequencing:Finishing(both)ThefinalGoalHighAccuracySequence:<1error/10,000basesAdaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenter?finishedquality“第十頁，共五十九頁。DNA測序原理第十一頁，共五十九頁。MilestonesofDNASequencing1953Watson,Crick,Franklin molecularstructureofDNA1976 Maxam,Gilbert DNAsequencingviachemicaldegradation1977 Sanger DNAsequencingviachaintermination1986 Hood;Ansorge automatedDNAsequencingwith

‘dyeprimer’

1989 Murray ‘cyclesequencing’withTaqpolymerase1991 NEN-DuPONT ‘dyeterminator’sequencing1999 ABI/MD 96wellcapillarysequencer第十二頁，共五十九頁。HowDNASequenceIsDetermined?PolyacrylamideGelElectrophoresisATC32PAT32PA32PTAGCTACGATCG32PATCGA32PATCGAT32PATCGATC32PATCGATCG32PATCGATCGA32PATCGATCGAT32PDNAfragmentshavingadifferenceofonenucleotidecanbeseparatedongelelectrophoresisButthesebandscan’ttellustheidentityoftheterminalnucleotidesIfthosebandwiththesameterminalnucleotidecanbegrouped,thenitispossibletoreadthewholesequence第十三頁，共五十九頁。雜交測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法流式細(xì)胞儀測序法大規(guī)模平行實測法、DNA芯片法經(jīng)典方法新技術(shù)方法Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法(Maxam和Gilbert,1977)Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger和Coulson1977)DNA測序方法：第十四頁，共五十九頁。生成互相獨立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機(jī)終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會均等，因此上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。

方法概述：第十五頁，共五十九頁。核酸序列分析的經(jīng)典方法:化學(xué)法:化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)酶法:DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)第十六頁，共五十九頁。Sanger'sMethod:Maxam-Gilbert'sMethod:HowtoObtainDNAFragments32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATATCGTAGCTAGCTATAGCTAGCTATAGCTAGCTAATCGA32PSpecificReactiontoG

ATCGSTOPATerminatedKeepongoingBiosyntheticmethodChemicalmethodTemplateorNon-radioactive(invisible)32PA,T,C,GAAnalogueDestroy→CleavageDestroy→CleavageATCGATCGATProducingvariousfragmentsJuangRH(2004)BCbasics第十七頁，共五十九頁。化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理：基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1種或2種堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5′末端，用4組不同的特異反應(yīng)，就可以使末端標(biāo)記的DNA分子切成不同長度的片段，其末端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜。第十八頁，共五十九頁。反應(yīng)的關(guān)鍵:使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng);堿基的特異性修飾;被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移;失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。常用的專門用來對核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯,甲酸和肼。

第十九頁，共五十九頁。

4組特異的反應(yīng)如下：(1)G反應(yīng)用硫酸二甲酯使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起甲基化鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在該處斷裂。(2)G+A反應(yīng)用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂。(3)T+C反應(yīng)用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基。(4)C反應(yīng)當(dāng)有鹽存在時，只有C與肼反應(yīng)，并被哌啶除去。哌啶促使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂。

第二十頁，共五十九頁。DNA的化學(xué)測序示意圖Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法先用限制性內(nèi)切酶把DNA切成10—200bp的測序材料，用堿性磷酸化酶處理該片段，消除5′末端上的磷酸，在5′OH端標(biāo)記32P，用多核苷酸磷酸激酶催化，標(biāo)記片段變性為單鏈，化學(xué)試劑在特定堿基位置降解單鏈DNA，產(chǎn)生一組長度不等的DNA片段，第二十一頁，共五十九頁。

反應(yīng)試劑G反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸T+C反應(yīng)：肼C反應(yīng)：NaCl+肼化學(xué)試劑在特定堿基位置降解單鏈DNA，產(chǎn)生一組長度不等的DNA片段，經(jīng)電泳和放射性自顯影后，從4個反應(yīng)系統(tǒng)統(tǒng)一閱讀，待測DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出。第二十二頁，共五十九頁。Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法不需要進(jìn)行酶催化反應(yīng)，因此不會產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來的誤差；對未經(jīng)克隆的DNA片段可以直接測序；化學(xué)降解測序法特別適用于測定含有如5-甲基腺嘌呤A或者G，C含量較高的DNA片段，以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。測定的長度短(如裂解位點的統(tǒng)計學(xué)分布等等)Advantages:Disadvantages:第二十三頁，共五十九頁。Sanger的酶降解測序法(鏈終止法)這項技術(shù)的關(guān)鍵是在DNA的聚合過程中依賴特殊反應(yīng)底物(2′3′—雙脫氧核苷三磷酸ddNTP)的特異性終止進(jìn)行DNA測序。第二十四頁，共五十九頁。DNAreplication:biochemistryOCNpurineorpyrimidinePOOOHPOOOHPOOOHHOPOOOHOOCNpurineorpyrimidineOH5’3’第二十五頁，共五十九頁。2'，3'ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們在脫氧核糖的3'位置缺少一個羥基。它們可以在DNA聚合酶作用下通過其5'三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于沒有3'羥基，它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。第二十六頁，共五十九頁。TheSangermethodrequiresMultiplecopiesofsinglestrandedtemplateDNAAsuitableprimer(asmallpieceofDNAthatcanpairwiththetemplateDNAtoactasastartingpointforreplication)DNApolymerase(anenzymethatcopiesDNA,addingnewnucleotidestothe3’endofthetemplateA‘pool’ofnormalnucleotidesAsmallproportionofdideoxynucleotideslabeledinsomeway(radioactivelyorwithfluorescentdyes)ThetemplateDNApiecesarereplicated,incorporatingnormalnucleotides,butoccasionallyandatrandomdideoxy(DD)nucleotidesaretakenup.ThisstopsreplicationonthatpieceofDNATheresultisamixofDNAlengths,eachendingwithaparticularlabeledDDnucleotide.Becausethedifferentlengths‘travel’atdifferentratesduringelectrophoresis,theirordercanbedetermined.第二十七頁，共五十九頁。酶法序列分析的原理

酶反應(yīng):DNA聚合酶(Klenow)電泳方向模板CCGGTAGCAACT3′5′GG5′3′標(biāo)記引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3′5′TCAACGATGG5′3′讀出模板互補(bǔ)序列讀出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGC第二十八頁，共五十九頁。第二十九頁，共五十九頁。DNAtemplateisdenaturedtosinglestrands.DNAprimer(with3’endnearsequenceofinterest)isannealedtothetemplateDNAandextendedwithDNApolymerase.Fourreactionsaresetup,eachcontaining:DNAtemplatePrimerannealedtotemplateDNADNApolymerasedNTPS(dATP,dTTP,dCTP,anddGTP)Next,adifferentradio-labeleddideoxynucleotide(ddATP,ddTTP,ddCTP,orddGTP)isaddedtoeachofthefourreactiontubesat1/100ththeconcentrationofnormaldNTPs.ddNTPspossessa3’-Hinsteadof3’-OH,competeinthereactionwithnormaldNTPS,andproducenophosphodiesterbond.ManualDideoxyDNAsequencing-Howitworks:第三十頁，共五十九頁。Whenevertheradio-labeledddNTPsareincorporatedinthechain,DNAsynthesisterminates.EachofthefourreactionmixturesproducesapopulationofDNAmoleculeswithDNAchainsterminatingatallpossiblepositions.Extensionproductsineachofthefourreactionmixutesalsoendwithadifferentradio-labeledddNTP(dependingonthebase).Next,eachreactionmixtureiselectrophoresedinaseparatelane(4lanes)athighvoltageonapolyacrylamidegel.Electrophoresisat70°C(2h).FixgelinHAc,drygel(1h).Autoradiography(24-48h).PatternofbandsineachofthefourlanesisvisualizedonX-rayfilm.Locationof“bands”ineachofthefourlanesindicatethesizeofthefragmentterminatingwitharespectiveradio-labeledddNTP.DNAsequenceisdeducedfromthepatternofbandsinthe4lanes.第三十一頁，共五十九頁。取代放射性同位素的方法地高辛,生物素:用地高辛,生物素代替發(fā)射性同位素示蹤測序反應(yīng)產(chǎn)物,最后用酶顯色反應(yīng)顯示出測序結(jié)果.銀染方法:把生成DNA分子核苷酸堿基順序的方法與一種超敏感的銀染方法相結(jié)合。這一新的技術(shù)組合使電泳分離的序列片段不依賴于儀器就直接可見。這種無放射性的系統(tǒng)包括通過用酶促雙氧鏈終止反應(yīng)形成一系列DNA序列片段，凝膠電泳分離這些片段，并把凝膠浸入超敏感的銀染溶液中,觀察引物延伸產(chǎn)物的銀染條帶,從而確定DNA分子的序列。第三十二頁，共五十九頁。熒光標(biāo)記物ddGTPddATPddTTPddCTP第三十三頁，共五十九頁。引物標(biāo)記法測序(DyePrimer)一個樣本，4個反應(yīng)。4個反應(yīng)中引物序列相同，但分別標(biāo)記有不同顏色的熒光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP反應(yīng)結(jié)束后，將4管反應(yīng)液混合，經(jīng)乙醇沉淀后上樣第三十四頁，共五十九頁。第三十五頁，共五十九頁。Advantagesofprimer-labels:cleanerDisadvantages:expensivetomanufacturefourreactionslimitedtocertainregions,customoligosorlimitedtoclonedinsertsbehind‘universal’primingsites.Solution:fluorescentdyeterminators(upgrade,seconditeration)第三十六頁，共五十九頁。終止法測序(DyeTerminator)一個樣本，1個反應(yīng)。反應(yīng)中包含分別帶4色熒光標(biāo)記的ddNTP(終止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP測序反應(yīng)結(jié)束后，采用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，除去過量的ddNTP后上樣。第三十七頁，共五十九頁。DideoxyDNAsequencingwastimeconsuming,radioactive,andthroughputwaslow,typically~300bpperrun.AutomatedDNAsequencingemploysthesamegeneralprocedure,butusesddNTPslabeledwithfluorescentdyes.Combine4dyesinonereactiontubeandelectrophoresinonelaneonapolyacrylamidegelorcapillarycontainingpolyacrylamide.UVlaserdetectsdyesandreadsthesequence.Sequencedataisdisplayedascoloredpeaks(chromatograms)thatcorrespondtothepositionofeachnucleotideinthesequence.Throughputishigh,upto1,200bpperreactionand96reactionsevery3hourswithcapillarysequencers.MostautomatedDNAsequencerscanloadroboticallyandoperatearoundtheclockforweekswithminimallabor.AutomatedDye-TerminatorDNASequencing:第三十八頁，共五十九頁。Advantagesofprimer-Terminator:--performedinasingletubeandtheresultingfragmentstobeloadedinasinglewell,resultingingreatersamplecapacityper“l(fā)ane”.Disadvantages:

--lesscleanerAmountoffluorescentDNAproducedislowandthusalargeamountoftemplateisrequiredtoproducegoodfluorescentsignals.Solution:Cyclesequencing第三十九頁，共五十九頁。CyclesequencingSequenase(T7)polymerasehasbeenawidelyusedenzymeforDNAsequencingwithradioactivenucleotidesbecauseofitshighprocessivityandlowerrorrate.HoweverusingthistypeofenzymeforfluorescentDNAsequencingisnotoptimalbecausetheamountoffluorescentDNAproducedislowandthusalargeamountoftemplateisrequiredtoproducegoodfluorescentsignals.TheenzymecurrentlyingeneraluseforautomatedfluorescentDNAsequencingisavariantofTaqDNApolymerase.ThethermostabilityofTaqpolymeraseallowsthesequencingreactionstobecarriedoutlikePCRreactions,andthereactionsarecalled"cyclesequencing"reactions.TheadvantageofusingthethermostableTaqpolymeraseovertheuseofSequenaseisthatmultipleroundsofsequencingcanbeperformedwithouttheneedtoaddfreshenzyme.第四十頁，共五十九頁。PolymeraseChainReaction95°C50-65°C72°C95°C50-65°C72°C95°C50-65°C72°CCyclesequencingreactionsareanalogoustoPCRsexceptonlyasingleprimerisusedandonlysinglestrandedproductsaregenerated.第四十一頁，共五十九頁。CycleSequencing95°C50-65°C72°C95°C50-65°C72°C95°C50-65°C72°C第四十二頁，共五十九頁。Cyclesequencing第四十三頁，共五十九頁。ThisallowstheuseofmuchlesstemplateDNA,Modifications(pointmutationsaffectingaminoacidresiduesinorneartheactivesite)totheTaqDNApolymerasehaveenabledittoincorporatethefluorescentdye-labeledterminatorsmoreevenlyandefficiently,resultinginveryevenpeakheightsoverasequenceread.AttemptshavebeenmadetodeveloppolymeraseswhichhavesomeoftheadvantageouspropertiesofSequenasebutarethermostablelikeTaq.Cyclesequencing第四十四頁，共五十九頁。測序技術(shù)進(jìn)展

同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳

多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳

單色熒光標(biāo)記平板電泳同位素標(biāo)記平板電泳ACGTACGT測序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T第四十五頁，共五十九頁。DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。

第四十六頁，共五十九頁。DNA的測序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA移動方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)旋光鏡/棱鏡組件DNA序列分析自動化:用熒光劑標(biāo)記DNA引物或ddNTP，帶有這種熒光劑標(biāo)記的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進(jìn)行測序反應(yīng)，跑DNA凝膠后用計算機(jī)檢測。第四十七頁，共五十九頁。Capillaryelectrophoresis第四十八頁，共五十九頁。AdvantagescapillaryLongerreadsMorereliable98-99%AutomatedsequencingreactionsAutomatedsampleapplicationNogelneedstobemadeAutomaticprocessingofresults第四十九頁，共五十九頁。大規(guī)模DNA測序的趨勢——自動化DNA測序?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；闹匾獥l件是自動化和機(jī)械化。目前，DNA制備、克隆文庫組建及篩選、DNA測序分析、數(shù)據(jù)的分析獲得、堿基序列閱讀、重疊克隆群順序排定等過程均已平行發(fā)展，自動化操作緊隨其后。隨著DNA測序不斷由半自動化向自動化過渡，原始數(shù)據(jù)積累將不成問題，關(guān)鍵是把全基因的散測序組裝起來，以實現(xiàn)DNA測序的完整性。第五十頁，共五十九頁。

未來的測序技術(shù)新型的電離技術(shù)如電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光吸收技術(shù)使利用質(zhì)譜法分析大片段DNA成為可能。其中四極