梅毒檢測課件

梅毒檢測課件第一頁，共三十頁，2022年，8月28日學(xué)習(xí)內(nèi)容一、梅毒的現(xiàn)狀及定義二、梅毒螺旋體的生物學(xué)特性三、梅毒實(shí)驗(yàn)室檢查方法四、梅毒血清學(xué)診斷試驗(yàn)五、梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果解釋六、梅毒實(shí)驗(yàn)室操作要求七、存在的問題第二頁，共三十頁，2022年，8月28日一、梅毒的現(xiàn)狀及定義一、梅毒的現(xiàn)狀1、近年來我國嚴(yán)峻的梅毒流行形勢（梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測不規(guī)范現(xiàn)狀）。2、今年衛(wèi)生部出臺梅毒10年控制規(guī)劃（梅毒血清學(xué)檢測、新方法、新技術(shù)的應(yīng)用性評估）3、目前我國僅對首次就診的孕產(chǎn)婦制訂了梅毒篩查方案，即：首先采用非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)或梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)之一進(jìn)行初篩，當(dāng)篩查結(jié)果為陽性時，需用另一類試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢。對一般人群尚無明確的篩查診斷流程。二、梅毒的定義梅毒是一種全球分布的系統(tǒng)性性傳播疾病。梅毒的病原體是蒼白螺旋體（Treponemiapallidum，TP）。人是梅毒的唯一傳染源，主要傳播途徑主要有性傳播、血液傳播和母嬰傳播3種，可侵犯人體全身器官，臨床表現(xiàn)分為一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潛伏梅毒，既能產(chǎn)生各種各樣的癥狀和體征，又可多年無癥狀而呈潛伏狀態(tài)，對人類健康危害極大。第三頁，共三十頁，2022年，8月28日二、梅毒螺旋體的生物學(xué)特性1.長度為8μm～20μm，平均8μm～10μm，直徑<0.2μm,有6～12個螺旋。2.因其透明不易染色，故稱為蒼白螺旋體。3.梅毒螺旋是一種小而纖細(xì)的螺旋狀微生物。4.梅毒螺旋體的特征是螺旋體整齊而規(guī)則，折光性強(qiáng)，較其他螺旋體亮。5.運(yùn)動緩慢而有規(guī)律，具有三種特征性運(yùn)動方式：常見是圍繞其長軸旋轉(zhuǎn)前后移動；其次是全身彎曲如蛇行；少見的是伸縮其螺旋間距而前進(jìn)6.梅毒螺旋體至今還不能在人工培養(yǎng)基上生長繁殖，目前只能將其接種到兔睪丸內(nèi)增殖、傳代和保存。以橫斷分裂的方式進(jìn)行增殖，世代時間為30小時～33小時。7.梅毒螺旋體在體外不易存活，煮沸、干燥，一般的消毒劑如汞劑、石炭酸、乙醇等很容易將其殺死。在41℃～42℃時經(jīng)過1小時～2小時也可將其殺死。8.低溫（-70℃～-196℃）下可保存數(shù)年并保持其形態(tài)、活力及毒性。第四頁，共三十頁，2022年，8月28日三、梅毒實(shí)驗(yàn)室檢查方法梅毒的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測方法較多，概括起來分為梅毒的病原體檢查、梅毒的血清免疫學(xué)檢查和梅毒的核酸檢查3大類。第五頁，共三十頁，2022年，8月28日（一）病原體檢查方法即梅毒螺旋體檢查，采用暗視野顯微鏡檢查或直接免疫熒光試驗(yàn)(directfluorescentantibodytest，DFA)，在顯微鏡下觀察梅毒螺旋體的特征性形態(tài)和運(yùn)動方式。該方法是診斷早期現(xiàn)癥最直接的方法，但由于受到患者用藥、檢測儀器狀態(tài)和檢測人員技能等條件的制約，本方法實(shí)際檢出率并不高。未檢測到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。本方法費(fèi)時費(fèi)力，也不適用于梅毒的大規(guī)模篩查。第六頁，共三十頁，2022年，8月28日（二）血清免疫學(xué)檢查方法1

1、非梅毒螺旋體抗原試驗(yàn)

檢測患者血清中宿主針對機(jī)體組織破壞后暴露的脂抗原或者螺旋體表面的脂質(zhì)產(chǎn)生的非特異性抗類脂抗原的抗體(反應(yīng)素)。檢測方法包括：快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)RPR)；甲苯胺紅不加熱血清(TRUST)；性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(VDRL)；不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)(USR)。目前最常用的是RPR和TRUST。由于在治療過程中反應(yīng)素滴度可呈動態(tài)變化，非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)常用于臨床療效觀察、復(fù)發(fā)或再感染的檢查。同時，由于該方法操作簡便、快速，成本低，特別適合基層應(yīng)用和人群調(diào)查。此類方法的缺點(diǎn)是反映不出既往感染，并且受其他疾病影響較大，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果第七頁，共三十頁，2022年，8月28日（二）血清免疫學(xué)檢查22、梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)

目的檢測梅毒螺旋體IgG、IgM抗體。檢測方法包括：梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）梅毒螺旋體顆血球凝集試驗(yàn)（TPHA）梅毒酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)（TP-ELISA）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）梅毒快速檢測（TP-RT）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗(yàn)（TP-WB）。梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)的共同優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，可以作為非梅毒螺旋體抗原試驗(yàn)初篩陽性標(biāo)本的復(fù)檢或確證試驗(yàn)

，但是，由于感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗(yàn)呈陽性，則患者長時間甚至終生陽性。所以這些方法不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染。亦不能作為療效觀察的指標(biāo)。第八頁，共三十頁，2022年，8月28日（三）梅毒螺旋體核酸檢查

可對血漿、血清、皮損部位組織液、淋巴穿刺液及腦脊髓液等標(biāo)本的梅毒螺旋體核酸采用PCR進(jìn)行檢測。核酸檢查的優(yōu)點(diǎn)是特異性高，在早期梅毒、神經(jīng)梅毒、先天梅毒和伴艾滋病梅毒等診斷中，以及螺旋體現(xiàn)癥感染和既往感染的鑒別診斷中具有一定的價值，也可應(yīng)用于梅毒螺旋體的耐藥性監(jiān)測、菌株流行病學(xué)分型。該方法缺點(diǎn)是成本高，對實(shí)驗(yàn)條件要求高并且易受多種因素影響，不宜做療效觀察。第九頁，共三十頁，2022年，8月28日四、梅毒血清學(xué)診斷試驗(yàn)?zāi)壳埃范镜膶?shí)驗(yàn)室血清學(xué)診斷技術(shù)是檢測梅毒螺旋體抗體主要方法有兩類：1.非梅毒螺旋體血清試驗(yàn)

2.梅毒螺旋體血清試驗(yàn)第十頁，共三十頁，2022年，8月28日（一）非梅毒螺旋體血清試驗(yàn)1非梅毒螺旋體抗原試驗(yàn)

：用心磷脂、卵磷脂、及膽固醇做抗原，檢測宿主對梅毒螺旋體表面的類脂物質(zhì)所產(chǎn)生的IgG和IgM抗體（抗心磷脂抗體，反應(yīng)素﹚包括VDRL、USR、RPR、TRUST試驗(yàn)等性病研究實(shí)驗(yàn)室玻片試驗(yàn)（VDRL）：屬于沉淀反應(yīng)，目前應(yīng)用最廣泛。用心擬脂、卵磷脂、膽固醇為抗原，可作定性和定量試驗(yàn)，操作簡單，費(fèi)用低，常用作大量病人的篩選及療效觀察。但在一期梅毒時敏感性不夠高，以及弱陽性時判讀結(jié)果困難為其缺點(diǎn)。血清不需加熱的反應(yīng)素試驗(yàn)（URS）：此法在國內(nèi)已逐步推廣使用，也是一種非螺旋體抗原原血清沉淀試驗(yàn)。其原理是在VDRL所用抗原中加入了EDTA（乙二胺四醋酸）和氯化膽堿，使操作更為簡單，更便于讀結(jié)果，其敏感性與特異性和VDRL相同?？焖傺獫{反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR):此試驗(yàn)是VDRL試驗(yàn)的一種改良方法。該法是在抗原中加入活性炭顆粒作為指示物，加入了氯化膽堿，因此血清不需滅活。特制的白色紙卡替代了玻片。試驗(yàn)結(jié)果易于判斷，肉眼即可觀察。也可用血漿進(jìn)行檢測，試驗(yàn)結(jié)果可保存?？乖?℃冰箱可保存1年。第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日（一）非梅毒螺旋體血清試驗(yàn)2臨床應(yīng)用價值：簡便、快速、敏感性和特異性較好可用于大規(guī)模的人群和產(chǎn)前篩查指示目前疾病的活動程度可作定量試驗(yàn)，用于療效觀察，早期梅毒經(jīng)有效治療后，抗體滴度會下降，並轉(zhuǎn)為陰性，如抗體滴度不下降或下降緩慢或下降后又上升，說明治療失敗、復(fù)發(fā)或再感染。晚期梅毒可自然轉(zhuǎn)陰。第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日

材

料(以RPR為例)RPR試劑盒：含RPR抗原；直徑為18mm圓圈的特制白色反應(yīng)卡片；標(biāo)準(zhǔn)針頭（60±1滴/mL）；RPR試驗(yàn)結(jié)果圖片。

其他：水平旋轉(zhuǎn)器。第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日定性試驗(yàn)a.吸取0.05mL血清或血漿加于卡片圈內(nèi)，并均勻地涂布在整個圈內(nèi)（每張紙卡有10個或12個反應(yīng)圈）；

b.將抗原輕輕搖勻，用標(biāo)準(zhǔn)針頭吸取抗原，每個標(biāo)本加1滴抗原；

c.將卡片置水平旋轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)8min；

d.立即在明亮光線下觀察結(jié)果。

結(jié)果

中到大的黑色絮狀物，液體清亮3+~4+強(qiáng)陽性

小到中的黑色絮狀物，液體較清亮2+陽性

小的黑色絮狀物，液體混濁1+弱陽性

僅見活性炭顆粒集于中央一點(diǎn)或均勻分散－陰性第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日定量試驗(yàn)RPR定量試驗(yàn)與TRUST試驗(yàn)相同。a.在圈內(nèi)加入0.05mL等滲鹽水（一般作6～8個稀釋度）勿將鹽水涂開；b.吸取0.05mL血清或血漿作系列稀釋（1:2～1:64），當(dāng)稀釋到最后的第6孔時，棄去0.05mL稀釋液。從第6孔起將血清稀釋液涂布整個圈內(nèi)，再涂布第5孔，依此向前到第1孔。

c.滴加抗原，旋轉(zhuǎn)時間、速度和觀察結(jié)果同定性試驗(yàn)。第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日RPR試驗(yàn)結(jié)果第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日（二）梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)梅毒螺旋體血清試驗(yàn)方法有:1.TPHA(梅毒螺旋體血凝試驗(yàn))2.TPPA（明膠顆粒凝集試驗(yàn)）3.FTA－ABS（熒光抗體吸收試驗(yàn)）4.TP-ELISA（免疫吸附試驗(yàn)）5.TP-WB－TP和TPLA（蛋白印跡試驗(yàn)）

方法簡便，結(jié)果易讀，適用于大量標(biāo)本的檢測。

FTA－ABS試驗(yàn)是“金標(biāo)準(zhǔn)”試驗(yàn)，具有敏感性高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。不能作為觀察療效優(yōu)點(diǎn)：特異性高，對非特異性試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)

缺點(diǎn)：不能區(qū)分是新發(fā)感染或治療后，通常終身持續(xù)陽性

第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）

原理:TPPA試驗(yàn)用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒，此致敏顆粒與人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)。明膠顆粒為玫瑰紅色，便于肉眼觀察結(jié)果。第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日材料（以TPPA為例）a.TPPA試劑盒：含蒸餾水（標(biāo)記A），用于溶解致敏顆粒、未致敏顆粒和質(zhì)控血清；標(biāo)本稀釋液（標(biāo)記B），用于稀釋血清標(biāo)本；致敏顆粒（標(biāo)記C），冷凍干燥品，用前30min按規(guī)定量加A液溶解并混勻；未致敏顆粒（標(biāo)記D），冷凍干燥品，用前30min按規(guī)定量加A液溶解并混勻；質(zhì)控血清（標(biāo)記E），冷凍干燥品，用時按規(guī)定量加入A液。b.其他：U型微量反應(yīng)板；微量加樣器(25μL)；微量滴管(C和D管)；移液管(微量移液管和刻度滴管)；微量板振蕩器。第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）試驗(yàn)前試劑應(yīng)恢復(fù)到15℃~30℃。a.B液加至微量反應(yīng)板孔內(nèi)，第1孔100μL，第2孔25μL，第3、4孔各25μL；

b.取血清25μL加至第1孔，混勻后取25μL至第2孔，混勻后取25μL至第3孔，混勻后取25μL至第4孔，混勻后棄去25μL。

c.第3孔加D液（未致敏顆粒）25μL，第4孔加C液（致敏顆粒）25μL；

d.將反應(yīng)板置振蕩器振蕩30s；

e.置有蓋濕盒，15～25℃避光孵育2h后，觀察結(jié)果。第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日

定量試驗(yàn)a.加B液至微量反應(yīng)板孔，第1孔～第4孔與定性試驗(yàn)相同，第5孔～第10孔各加25μL；

b.取血清25μL加至第1孔，如定性試驗(yàn)稀釋方法，從第2孔～第10孔混勻，混勻后第10孔棄去25μL；

c.第3孔加D液25μL，第4孔～第10孔各加C液25μL；

d.以后步驟同定性試驗(yàn)。結(jié)果以最高血清稀釋度能產(chǎn)生陽性反應(yīng)的稀釋度為抗體滴度結(jié)果顆粒光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊陽性4+

顆粒光滑覆蓋大部分孔底陽性3+

顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一顆粒環(huán)陽性2+

顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一明顯顆粒環(huán)陽性1+

顆粒沉集孔底，中央形成一小點(diǎn)可疑±

顆粒緊密沉積孔底中央陰性-

第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日報告方法

a.陽性報告：定性試驗(yàn)，血清在1:80以上稀釋度與致敏顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)（1+或更強(qiáng)），與未致敏顆粒（第3孔）不發(fā)生凝集反應(yīng)。定量試驗(yàn)則應(yīng)報告發(fā)生陽性反應(yīng)的血清最高稀釋度，為血清滴度。

b.陰性報告：血清與致敏顆粒和未致敏顆粒均不發(fā)生凝集反應(yīng)。第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日

注意事項(xiàng)

a.微量反應(yīng)板要清潔干凈，孔內(nèi)無異物。

b.加入血清后，使用微量板振蕩器振蕩反應(yīng)板，而不可使用水平旋轉(zhuǎn)儀。

c.試劑盒不可置于0℃以下，防止凍結(jié)。不同批號試劑不可混合使用。

d.如未致敏顆粒出現(xiàn)凝集反應(yīng)，應(yīng)將血清進(jìn)行吸收處理后再進(jìn)行試驗(yàn)，或用其他試驗(yàn)方法。

第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日梅毒血清反應(yīng)的假陽性反應(yīng)（1）梅毒血清反應(yīng)假陽性的分類①技術(shù)性假陽性反應(yīng)由于標(biāo)本的保存不當(dāng)（如細(xì)胞污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過期、或?qū)嶒?yàn)室操作錯誤所造成。②生物學(xué)假陽性反應(yīng)是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清試驗(yàn)出現(xiàn)陽性（2）急性生物學(xué)假陽性反應(yīng)很多非梅毒螺旋體感染性疾病，如風(fēng)疹、水痘、傳染性單核細(xì)胞增多癥、病毒性肝炎、上呼吸道感染、肺炎球菌性肺炎、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、活動性肺結(jié)核、絲蟲病和溝端螺旋體病等。（3）慢性生物學(xué)假陽性反應(yīng)可持續(xù)6個月以上或數(shù)年，甚至終生。第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日五、梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果解釋

血清試驗(yàn)結(jié)果臨床意義USRRPRTRUSTVDRLTPHATPPAFTA-ABSELISA一一一排除梅毒,或一期梅毒的早期或艾滋病患者合并梅毒+++現(xiàn)癥梅毒﹙梅毒孕婦所生的嬰兒除外﹚+一一生物學(xué)假陽性一++早期梅毒經(jīng)治療后第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日六、梅毒實(shí)驗(yàn)室操作要求

1．實(shí)驗(yàn)室要求清潔明亮，溫度保存在23～29℃。2．儀器設(shè)備制定詳細(xì)的操作說明書，定期維護(hù)。3．玻璃器皿或耗材要清潔干凈。4．試驗(yàn)操作要適合工作需要，操作人員要持證上崗。5．操作規(guī)程要確實(shí)可行，不得隨意改變。6.認(rèn)真精確操作標(biāo)本和試劑，包括各種移液器和所操作的用具量的準(zhǔn)確。第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日7．定期檢查說明書，操作保持與說明書的一致。8．每次試驗(yàn)設(shè)立陽性和陰性質(zhì)控，包括反應(yīng)性，介質(zhì)和每次試驗(yàn)操作記錄是否一致性；9．標(biāo)本不應(yīng)溶血、乳糜狀，應(yīng)標(biāo)記血漿或血清，腦脊液是否有紅細(xì)胞；10．常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有一定的空間，所有試驗(yàn)的記錄，試驗(yàn)鑒定，溫度記錄和原始數(shù)據(jù)應(yīng)保留；11．認(rèn)真監(jiān)督報告方式和記錄筆誤。

第二十七頁，共三十頁