乙醇對谷氨酸棒桿菌EGFP表達(dá)和生長的作用,分子生物學(xué)論文

乙醇對谷氨酸棒桿菌EGFP表達(dá)和生長的作用,分子生物學(xué)論文摘要：谷氨酸棒桿菌是一種傳統(tǒng)的工業(yè)微生物。為研究乙醇對谷氨酸棒桿菌表示出外源蛋白的影響,將組成型表示出加強綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的谷氨酸棒桿菌接入含有不同濃度乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)低濃度(1%)乙醇在被利用的經(jīng)過中能夠顯著提高菌體的單位熒光強度。將乙醇與常見的幾種營養(yǎng)物質(zhì)進行了比照,發(fā)現(xiàn)乙醇在促進菌體生長以及蛋白表示出方面表現(xiàn)更好。除此之外,根據(jù)乙醇被利用時異檸檬酸裂合酶(Isocitratelyase,ICL)被強烈誘導(dǎo)的特性構(gòu)建了一個表示出能力較強、誘導(dǎo)效果較好的自誘導(dǎo)表示出載體。本文關(guān)鍵詞語：谷氨酸棒桿菌;乙醇;蛋白表示出;碳源;Abstract：Corynebacteriumglutamicumisatraditionalindustrialmicroorganism.InordertostudytheinfluenceofethanolontheexpressionofexogenousproteininCorynebacteriumglutamicum,thestrainthatcanconstitutivelyexpresstheenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)wasinoculatedintotheculturemediumcontainingdifferentconcentrationsofethanol,anditwasfoundthattheunitfluorescenceintensitycouldbesignificantlyelevatedintheprocessoftheutilizationoflowconcentration(1%)ethanol.Herewealsodemonstratedthatethanolhadbetterperformancesbothincellgrowthandproteinproductioncomparedwithseveralcommonnutrients.Inaddition,anauto-inducibleexpressionvectorwithhighexpressionabilityandinducibleratewasconstructedaccordingtothestronginductionoftheisocitratelyase(ICL)inthepresenceofethanolutilization.Keyword：Corynebacteriumglutamicum;ethanol;proteinexpression;carbonsource;谷氨酸棒桿菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性工業(yè)微生物，廣泛用于一些有機酸的合成[1]。因具有無內(nèi)毒素、抗逆性強、蛋白酶水平較低等優(yōu)勢，近年來谷氨酸棒桿菌也正逐步被開發(fā)用于生物燃料的生產(chǎn)以及外源重組蛋白的表示出[2,3]。乙醇是各種分子伴侶的強烈誘導(dǎo)劑，分子伴侶表示出水平的提高能夠促進重組蛋白的可溶性表示出[4,5]。盡管也有一些添加乙醇后對大腸桿菌蛋白表示出產(chǎn)生有益效果的報道，但這一策略往往會由于大腸桿菌的乙醇耐受性較差而無法實現(xiàn)[6,7]。相比之下，革蘭氏陽性菌株的有機溶劑耐受性要高于革蘭氏陰性菌株，谷氨酸棒桿菌又擁有較強的乙醇脫氫酶活性，能夠利用乙醇作為唯一碳源生長[8]。為了研究添加乙醇的策略能否能夠?qū)劝彼岚魲U菌表示出重組蛋白產(chǎn)生促進作用，筆者就乙醇添加對于谷氨酸棒桿菌EGFP的表示出以及菌體生長等方面的影響進行了研究。1、材料與方式方法1.1、材料1.1.1、菌株、質(zhì)粒和引物谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647(CorynebacteriumglutamicumCGMCC1.15647)、大腸桿菌DH5、質(zhì)粒pXMJ19由本實驗室保藏。質(zhì)粒p19-0(pXMJ19-mut△Ptac，△lacI,T7Isolator)、pXMJ19-EGFP(pXMJ19-mut，△lacI,EGFP)由本實驗室構(gòu)建和保藏[9]。自誘導(dǎo)載體PICL-B-EGFP在本研究中構(gòu)建。所用引物見表1，引物的合成和測序工作均由蘇州金唯智公司完成。表1本試驗所用的引物1.1.2、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)。除非另有講明，谷氨酸棒桿菌使用LBB(LB+1%腦心浸出液)培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200r/min。抗生素使用氯霉素，作用終濃度在大腸桿菌中為34mg/L，在谷氨酸棒桿菌中為10mg/L。1.1.3、酶和試劑限制性內(nèi)切酶(ThermoFisherScientific);Q5高保真DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs);EsTaqMasterMix(康為世紀(jì)生物科技);T4DNA連接酶(TaKaRaBio);質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒(AxygenScientific);基因組提取試劑盒(天根生化科技)。1.1.4、主要耗材和儀器高速冷凍離心機和PCR儀(ThermoFisherScientific);超聲波細(xì)胞破碎儀:VCX800(SONICS);熒光分光光度計(上海棱光技術(shù))。1.2、方式方法1.2.1、質(zhì)粒構(gòu)建利用引物PICL-B-EGFP-UF/R對谷氨酸棒桿菌基因組進行PCR擴增，得到帶有HindⅢ/以及bsaⅠ接頭的異檸檬酸裂合酶編碼基因的啟動子區(qū)域(從ATG上游500bp到ATG下游59bp，包含了轉(zhuǎn)錄起始位點以及完好的5末端非翻譯區(qū))。利用引物PICL-B-EGFP-DF/R對含有EGFP的質(zhì)粒pXMJ19-EGFP[9]進行PCR擴增，得到含有bsaⅠ以及BamHⅠ接頭的EGFP片段(其5末端含有一個保守的核糖體結(jié)合位點AAAGGAGGA)。將得到的啟動子片段和EGFP片段分別用上述接頭對應(yīng)的內(nèi)切酶處理。酶切、純化后將兩片段與HindⅢ和BamHⅠ處理過的p19-0載體一起進行連接反響。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，構(gòu)建得到乙醇誘導(dǎo)載體PICL-B-EGFP。1.2.2、生長曲線的繪制將過夜培養(yǎng)的谷氨酸棒桿菌接種于50mL新鮮培養(yǎng)基中，使初始OD600值為0.3。用移液器精到準(zhǔn)確分裝48mL培養(yǎng)物至24多孔培養(yǎng)板中，每孔2mL。置于30℃，200r/min搖床中培養(yǎng)，每隔2h從對應(yīng)的孔中汲取培養(yǎng)物用于OD600和熒光強度檢測。1.2.3、加強型綠色熒光蛋白強度的測定將待測的谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)物用PBS緩沖液洗滌兩次，重懸并將OD600調(diào)至0.5左右，使用熒光分光光度計測定熒光強度。激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為507nm。1.2.4、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品的制備收集所有用于蛋白膠檢測的樣品，棄去上清。用PBS緩沖液洗滌兩遍，稱取一樣濕重的菌體(約0.03g)。參加1mLPBS緩沖液重懸，利用超聲波破碎樣品(間隔2s，破碎1s,25%功率，15min)至不再渾濁，破碎經(jīng)過置于冰水混合物上。破碎后12000r/min,4℃離心15min。取適量上清參加5蛋白膠上樣緩沖液混勻，置于沸水浴煮5min。2、結(jié)果與分析2.1、不同乙醇濃度對tac啟動子表示出EGFP的影響檢測了含有pXMJ19-EGFP載體、tac啟動子組成型表示出EGFP的谷氨酸棒桿菌在0%、1%、3%和5%乙醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后的OD600以及熒光強度。如此圖1所示，顯然較高濃度的乙醇(4%、5%)對于谷氨酸棒桿菌的生長和外源蛋白表示出都是有阻礙的。低濃度的乙醇(1%、2%)不但能促進生物量大幅提升，而且能夠顯著提高外源蛋白的表示出水平。有趣的是，谷氨酸棒桿菌在3%乙醇濃度下培養(yǎng)24h后，熒光強度和菌體OD600與不加乙醇的對照相比都基本一致，似乎展現(xiàn)出了某種平衡性。圖1不同濃度乙醇對單位熒光強度和OD600的影響Figure1EffectsofethanolconcentrationonunitfluorescenceintensityandOD600由此可見，乙醇的添加對谷氨酸棒桿菌存在著正反兩個方面的效應(yīng):高于某個平衡濃度時，菌體生長量和外源蛋白表示出水平下降。低于平衡濃度時，生物量提高、外源蛋白表示出水平提高。需要講明的是，這一平衡濃度的詳細(xì)數(shù)值天經(jīng)地義會與菌株、含有的質(zhì)粒以及培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。同時，平衡濃度所指的不僅僅僅是單純的使菌體生長與對照組最接近時的乙醇添加濃度，這一濃度某種程度上也反映了菌體在脅迫環(huán)境中的總體生長經(jīng)過。實驗中發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)至16h之后，平衡濃度及以上的實驗組和不加乙醇的對照組菌體生長基本都已停滯或極為緩慢，但初始添加了低濃度乙醇的樣本此時還沒有到達(dá)發(fā)酵終點，仍有較高的生長速率(圖2)。2.2、乙醇在被利用的經(jīng)過中促進了綠色熒光蛋白的表示出鑒于低濃度乙醇的添加對谷氨酸棒桿菌EGFP表示出展現(xiàn)出了有益效果，筆者對其做了進一步的討論。谷氨酸棒桿菌具有較強的乙醇脫氫酶活性，乙醇會經(jīng)過乙醇脫氫酶和醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸，然后通過乙酸激酶(acetatekinase,AK)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶(Phosphotransacetylase,PTA)轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A繼而進入乙醛酸循環(huán)和三羧酸循環(huán)途徑被菌體利用。并且，谷氨酸棒桿菌存在著與大腸桿菌中葡萄糖效應(yīng)類似的機制，即菌體會優(yōu)先利用速效碳源[10]。上述表示出EGFP的谷氨酸棒桿菌的生長和單位熒光強度變化曲線如此圖2所示，不難看出EGFP水平相比對照的提高發(fā)生在菌體的二次生長經(jīng)過中，這一階段乙醇作為最主要的遲效碳源被菌體利用。葡萄糖的存在能夠顯著抑制乙醇脫氫酶等乙醇代謝途徑關(guān)鍵酶的表示出進而抑制乙醇的利用[8,11]。如此圖3所示，在培養(yǎng)基中額外添加1%的葡萄糖、培養(yǎng)24h后，菌體量相比對照大幅增長，但EGFP表示出水平下降。而在已含有1%葡萄糖的培養(yǎng)基中再參加1%乙醇后，菌體量和EGFP相比單純添加葡萄糖的培養(yǎng)基卻有所降低。由此可見，乙醇是在被利用的經(jīng)過中促進了EGFP表示出的提高，乙醇對菌體的一些脅迫刺激作用例如對分子伴侶的誘導(dǎo)并不是熒光強度提高的原因。圖2生長曲線和單位熒光強度的變化Figure2Growthcurvesandchangesofunitfluorescenceintensity2.3、乙酸無法完全替代乙醇誘導(dǎo)EGFP的表示出乙醇的利用會促進菌體的生長，熒光蛋白表示出水平的提升也許只是更多代次的菌體增殖所致。乙酸是乙醇代謝經(jīng)過的中間產(chǎn)物，谷氨酸棒桿菌同樣能夠充分利用乙酸作為唯一碳源生長。在Arndt等的報道中，谷氨酸棒桿菌在含有1%乙醇的合成培養(yǎng)基中生長速率要略低于含有同樣濃度乙酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基[8]。如此圖4所示，添加1%乙酸培養(yǎng)上述EGFP表示出菌株48h后，單位熒光強度相比對照只提高了約20%。在不添加葡萄糖的MM合成培養(yǎng)基[8]中，以乙醇為唯一碳源培養(yǎng)時的單位熒光強度仍會比乙酸高出約70%。因而，無法完全用乙酸的利用去解釋乙醇對EGFP表示出的誘導(dǎo)效應(yīng)。在Arndt等的表示出譜數(shù)據(jù)中，有39個基因在以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中表示出水平顯著高于葡萄糖或乙酸碳源培養(yǎng)基，這些基因的功能牽涉了鋅、鎂、錳離子的吸收以及三羧酸循環(huán)途徑[8]。除此之外，一些脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶等)的表示出水平也會在以乙醇為唯一碳源時大幅提高，因而乙醇利用所導(dǎo)致的熒光蛋白表示出提高或許和胞內(nèi)復(fù)原力水平有關(guān)。圖3添加葡萄糖對單位熒光強度的影響Figure3Effectofglucosesupplementationonunitfluorescenceintensity圖4乙酸和乙醇對EGFP表示出影響的比照Figure4ComparisonoftheinfluenceonEGFPexpressionbetweenacetateandethanol.Statisticallysignificantdifferencescomparedwithcontrolsamplewereindicatedwithasterisks*:P0.05;**:P0.012.4、幾種常見培養(yǎng)基的效果比擬考慮到低濃度的乙醇一方面能在菌體的二次生長階段作為碳源被利用刺激谷氨酸棒桿菌大量生長，另一方面又對外源蛋白表示出有顯著的促進作用。因而當(dāng)利用谷氨酸棒桿菌進行外源蛋白表示出時，乙醇或許更合適作為補料碳源。如前文所述，谷氨酸棒桿菌的蛋白表示出與大腸桿菌一樣會遭到速效碳源的抑制，因此培養(yǎng)基中添加葡萄糖對于外源蛋白表示出不利。利用大腸桿菌表示出蛋白時往往會以甘油為碳源補料，然而谷氨酸棒桿菌很多關(guān)于外源蛋白表示出的研究仍然會以葡萄糖作為主要的碳源和能源，所使用的半合成培養(yǎng)基也大多是在酵母粉或LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進行改良，例如添加腦心浸出液(brainheartinfusion,BHI)等物質(zhì)[13]。因而就乙醇和其他營養(yǎng)物質(zhì)的添加對谷氨酸棒桿菌熒光蛋白表示出和菌體生長量的影響進行了比照。如此圖5所示，培養(yǎng)48h后，無論是OD600還是單位的熒光蛋白表示出強度，在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加乙醇都要比添加昂貴的腦心浸液要好。有趣的是，完全由4%腦心浸出液構(gòu)成的BHI培養(yǎng)基固然也能顯著促進菌體生長，但腦心浸出液的添加似乎會對蛋白表示出產(chǎn)生一定的抑制作用。圖5不同營養(yǎng)物質(zhì)的添加對EGFP和OD600影響的比照Figure5ComparisonoftheinfluenceonOD600andEGFPlevelbetweenvariousnutrients2.5、乙醇誘導(dǎo)啟動子的構(gòu)建如此圖6所示，在對圖2中36h的樣品進行的SDS檢測中，1%乙醇的添加會使得菌體胞內(nèi)蛋白多出一條蛋白條帶，該條帶相比其他被1%乙醇誘導(dǎo)的蛋白更為顯著，這意味著乙醇對該啟動子的誘導(dǎo)幅度較大又或者該基因的翻譯效率較高。經(jīng)質(zhì)譜檢測該條帶是乙醛酸循環(huán)中的異檸檬酸裂合酶(Isocitratelyase,ICL)。為了對乙醇作為遲效碳源及其誘導(dǎo)外源蛋白表示出的效應(yīng)加以利用，實驗用該基因啟動子以雙順反子的形式構(gòu)建了EGFP的表示出載體，并對其誘導(dǎo)表示出熒光蛋白的能力進行了測試。華而不實雙順反子構(gòu)造的應(yīng)用有助于提高翻譯效率以及mRNA穩(wěn)定性(構(gòu)建原理見圖7)[14,15]。如此圖8所示，在含有1%乙醇的LBB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h后，相比不添加乙醇的對照該表示出載體具有9.5倍的誘導(dǎo)效果，相比本身對數(shù)期(4h)的表示出水平有著21.1倍自誘導(dǎo)效果。添加1%乙醇的條件下該自誘導(dǎo)載體的表示出水平到達(dá)了tac啟動子約65%的強度，高出不添加1%乙醇時的tac啟動子約30%。Kim等開發(fā)并優(yōu)化的谷氨酸棒桿菌自誘導(dǎo)載體表示出sfGFP時的自誘導(dǎo)倍數(shù)為3.5倍，但由于該報道并沒有與傳統(tǒng)的tac啟動子進行比照，培養(yǎng)條件和表示出的蛋白種類也有差異，因此無法對兩種自誘導(dǎo)啟動子的表示出強度進行直接比照[16]。圖6SDS檢測乙醇利用引起的胞內(nèi)蛋白表示出變化Figure6SDSanalysisofintracellularproteinchangeinducedbyethanolutilization圖7PICL-B-EGFP雙順反子表示出載體構(gòu)造示意圖Figure7ArchitectureofbicistronicexpressionvectorPICL-B-EGFPTSP:transcriptionstartpoint;SD:Shine-Dalgarnosequence圖8PICL-B-EGFP載體的EGFP表示出強度和誘導(dǎo)效果Figure8EGFPexpressionstrengthandinducibilityofPICL-B-EGFP以下為參考文獻(xiàn)[1]WIESCHALKAS,BLOMBACHB,BOTTM,etal.Bio-basedproductionoforganicacidswithCorynebacteriumglutamicum[J].MicrobialBiotechnology,2020,6(2):87-102.[2]LIUX,YANGY,ZHANGW,etal.ExpressionofrecombinantproteinusingCorynebacteriumglutamicum:progress,challengesandapplications[J].CriticalReviewsinBiotechnology,2021,36(4):652-664.[3]JOJIMAT,NOBURYUR,SASAKIM,etal.MetabolicengineeringforimprovedproductionofethanolbyCorynebacteriumglutamicum[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2021,99(3):1165-1172.[4]MARTINEZ-ALONSOM,GARCIA-FRUITOSE,FERRER-MIRALLESN,etal.Sideeffectsofchaperonegeneco-expressioninrecombinantproteinproduction[J].MicrobialCellFactories,2018,9:64.[5]HORINOUCHIT,TAMAOKAK,FURUSAWAC,etal.Transcriptomeanalysisofparallel-evolvedEscherichiacolistrainsunderethanolstress[J].BMCGenomics,2018,11:579.[6]THOMASJG,BANEYXF.DivergenteffectsofchaperoneoverexpressionandethanolsupplementationoninclusionbodyformationinrecombinantEscherichiacoli[J].ProteinExpressionandPurification,1997,11(3):289-296.[7]楊軍蘭,徐焰,蘇明權(quán),等.乙醇對結(jié)核分枝桿菌Mr38000蛋白在大腸桿菌中可溶性表示出的促進作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,26(4):360-362.[8]ARNDTA,AUCHTERM,ISHIGET,etal.EthanolcatabolisminCorynebacteriumglutamicum[J].JournalofMolecularMicrobiologyandBiotechnology,2008,15(4):222-233.[9]趙子豪.谷氨酸棒桿菌表示出組件的開發(fā)與應(yīng)用[D].無錫:江南大學(xué).2021.[10]ARNDTA,EIKMANNSBJ.ThealcoholdehydrogenasegeneadhAinCorynebacteriumglutamicumissubjecttocarboncataboliterepression[J].JournalofBacteriology,2007,189(20):7408-7416.[11]SUBHADRAB,LEEJK.ElucidationoftheregulationofethanolcatabolicgenesandptsGusingaglxRandadenylatecyclasegene(cyaB)deletionmutantsofCorynebacteriumglutamicumATCC13032[J].JournalofMicrobiologyandBiotechnology,2020,23(12):1683-1690.[12]EIKMANNSBJ,METZGERM,REINSCHEIDD,etal.AmplificationofthreethreoninebiosynthesisgenesinCor