第六章核酸的研究技術

第六章核酸的研究技術演示文稿第一頁，共一百零二頁。（優(yōu)選）第六章核酸的研究技術第二頁，共一百零二頁。第三頁，共一百零二頁。解鏈溫度（融解溫度，Tm）

(meltingtemperature)：

使50%的DNA發(fā)生變性時的環(huán)境溫度。

DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈是在一個相當窄的溫度內完成的。第四頁，共一百零二頁。第五頁，共一百零二頁。增色效應：

DNA變性后對260nm紫外光收增加的現(xiàn)象。第六頁，共一百零二頁。DNA的復性（renaturation)：

在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可再恢復成天然的雙螺旋結構的過程。

熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱為退火(annealing)。第七頁，共一百零二頁。第八頁，共一百零二頁。減色效應：變性DNA復性后對260nm紫外光吸收減少的現(xiàn)象。第九頁，共一百零二頁。1.常用的變性方法：

①熱變性

②酸堿變性

③化學試劑變性

第十頁，共一百零二頁。2.影響復性的因素

①序列簡單的分子復性快，如poly(dT)和poly(dA)識別快②DNA片段愈大，擴散速度愈低，復性慢③離子強度↑→有利于復性④DNA濃度↑→復性↑

Tm值的估算①<20bpTm=4（G+C）+2（A+T）②>20bpTm=69.3+0.41(G+C)%③ Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61×（甲酰胺%）

第十一頁，共一百零二頁。核酸雜交：不同來源的兩條核酸單鏈由于具有互補序列，在一起復性時，互補序列配對，形成雜化分子。++第十二頁，共一百零二頁。第十三頁，共一百零二頁。第十四頁，共一百零二頁。二、影響雜交的因素

1.核酸分子的濃度和長度

2.溫度：比Tm低25℃~30℃較適宜3.離子強度：離子強度↑→雜交反應率↑

第十五頁，共一百零二頁。

4.雜交液中的甲酰胺

甲酰胺能降低核酸雜交的Tm，含30%—50%甲酰胺的雜交溶液溫度能降低到30—42℃。使用甲酰胺的優(yōu)點：

①低溫下探針更穩(wěn)定；②能更好地保留非共價結合的核酸。第十六頁，共一百零二頁。注意：①待測核酸順序與探針順序同源性高的雜交，用水溶液時取68℃，用50%甲酰胺溶液時取40℃。②待測核酸順序與探針同源性不高時，以50%甲酰胺溶液在35—40℃雜交。第十七頁，共一百零二頁。5.核酸分子的復雜性直接影響復性幾率。6.非特異性雜交反應：在雜交前將非特異性位點進行封閉，以減少對探針的非特異性吸附作用。常用封閉物：①變性非特異DNA：鮭魚精子DNA， 小牛胸腺DNA②高分子化合物：Denhardt溶液 脫脂奶粉

第十八頁，共一百零二頁。三、核酸探針

（一）探針的選擇原則

1.高度的特異性

2.制備探針的難易性和檢測手段的靈敏法

（二）探針的種類

第十九頁，共一百零二頁。1.基因組DNA探針從基因組DNA文庫中選取某一基因片段

↓

與載體連接（質粒、噬菌體）↓克隆(PCR擴增)↓酶切優(yōu)點：①無性繁殖、制備方法簡單；②不易降解（與RNA比較）；③標記方法成熟。

第二十頁，共一百零二頁。2.cDNA探針（complementaryDNA）

↓S1核酸酶切平兩端優(yōu)點：不含內含子及高度重復序列但不易獲得↓載體連接↓克隆通過逆轉錄↓雙鏈cDNA加接頭 ↓限制酶粘性末端第二十一頁，共一百零二頁。3.RNA探針：檢測DNA和mRNA

優(yōu)點：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性 雜交較少,未雜交探針可用RNase 降解，減少本底的干擾。

缺點：易降解，標記方法復雜

第二十二頁，共一百零二頁。4.寡核苷酸探針

優(yōu)點：①可根據需要合成相應序列； ②探針短,序列復雜性低,分子量小， 因此雜交時間短; ③長度只有10—50bp，該識別序 列內1個堿基的變化可明顯降低雜 交Tm值。 ④可大量合成，價格低，能夠用酶 學或 化學方法進行非放射性標記。

第二十三頁，共一百零二頁。（三）探針設計原則：

①長度：10~50bp②堿基成分:G+C含量為40%~60%

③探針分子內無互補序列。④避免同一堿基重復出現(xiàn)。⑤一旦選定某一序列后，尚需與已知的各種基因序列進行同源性比較，與非靶區(qū)域的同源性不應超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基同源。第二十四頁，共一百零二頁。（四）探針標記物的選擇

理想的標記物：

①具有高度的靈敏性②與探針結合后，不影響雜交及探針的主要理化特性③檢測方法高靈敏性、高特異性，假陽性率低，環(huán)境污染少，價格低廉；④若用酶促方法標記，應對Km影響不大第二十五頁，共一百零二頁。常用的放射性標記物

常用探記探針的同位素：

32P、3H、35S、14C、125I、131I第二十六頁，共一百零二頁。2.特性：

①檢測特異性強；②靈敏度高；③對酶促反應無任何影響，也不影響堿基配對的特異性和穩(wěn)定性；④易造成放射性污染；⑤半衰期短的同位素應用受到限制，隨用隨標記，立即使用，不能長時間存放。第二十七頁，共一百零二頁。3.探針標記的方法

①缺口平移法（nicktranslation）實質：用[α-32P]dNTP取代原來DNA鏈中不帶同位素的同種核苷酸，生成的兩條鏈均被同位素標記。第二十八頁，共一百零二頁。第二十九頁，共一百零二頁。②隨機引物法（randompriming）人工合成的6~8個核苷酸長的各種不同排列順序的混合物，它們可以隨機地互補到DNA探針的某一處，作為引物，在Klenow片段作用下，合成與探針DNA互補的DNA鏈，當在反應液中加入[α-32P]dATP時，即可形成放射性同位素標記的DNA探針，但探針DNA序列是長短不等的。優(yōu)點：比活度高，結果穩(wěn)定第三十頁，共一百零二頁。第三十一頁，共一百零二頁。③用T4多核苷酸激酶標記DNA5ˊ末端

5ˊ-pCpGpApCpG-3ˊ

堿性磷酸酶(AKP）

5ˊ-HOCpGpApCpG-3ˊ

[γ-32P]ATPT4噬菌體多核苷酸激酶（PNK）

5ˊ-32PCpGpApCpG-3ˊ

第三十二頁，共一百零二頁。④Klenow片段快速標記DNA探針末端

用枯草桿菌蛋白酶切割可得兩條多肽鏈

N——C5ˊ→3ˊ外切酶

3ˊ→5ˊ外切酶

5ˊ→3ˊ聚合酶

小片段(36000) Klenow片段（67000）

3′—CTTAAG—5′5′—GAATTC—3′EcoRⅠ

5′——G AATTC——3′

3′——CTTAA G——5′

Klenow,dNTP,[α-32P]dATP

5ˊ——GAATTAATTC——3ˊ

3ˊ——CTTAATTAAG——5

第三十三頁，共一百零二頁。常用的非放射性標記

優(yōu)點：無環(huán)境污染，可較長時間貯存方法：1.酶標記法

2.化學標記法要求：標記物應具有耐熱、對組織細胞無特異親和性、分子量小，對探針雜交無影響或影響甚小，不影響DNA三維空間構象的形成。常用的標記物：生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、補骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylominofluorene）第三十四頁，共一百零二頁。1.生物素標記核酸探針Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。2.地高辛（Dig）標記核酸探針第三十五頁，共一百零二頁。第三十六頁，共一百零二頁。第三十七頁，共一百零二頁。第三十八頁，共一百零二頁。第三十九頁，共一百零二頁。第四十頁，共一百零二頁。四、核酸分子雜交技術

（一）類型：根據反應環(huán)境分為1.固相雜交：將需要雜交的一條核酸鏈先固定 在固體支持物上，另一條核酸 鏈游離在液體中。2.液相雜交：參與反應的兩條核酸鏈都游 離在液體中。第四十一頁，共一百零二頁。（二）固體支持物種類硝酸纖維素膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠、微孔板等。選擇原則：①具有較強的結合核酸的能力；②與核酸的結合比較穩(wěn)定③盡量少的非特異性吸附第四十二頁，共一百零二頁。（三）常用固相雜交類型Southern印跡雜交、Northern印跡雜、菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、組織原位雜交、夾心雜交等。第四十三頁，共一百零二頁。1.Southern印跡雜交主要步驟：第四十四頁，共一百零二頁。純化的待測DNA樣品

瓊脂糖凝膠電泳分離酶切DNA片段

凝膠上DNA變性

中和

DNA轉印至NC膜

預雜交

限制性內切酶酶切后（EDTA，65℃滅活限制酶）

變性液（堿變性）

Tris緩沖液

高鹽下

烘干、固定

雜交

放射自顯影

結果分析

第四十五頁，共一百零二頁。第四十六頁，共一百零二頁。southern印跡載體凝膠吸水紙緩沖液濾紙固定到載體第四十七頁，共一百零二頁。2.Northern印跡雜交是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到NC膜上的方法。與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為Westernblotting。3.斑點雜交（dotblot）(線狀圓形)第四十八頁，共一百零二頁。4.原位雜交（insituhybridization）直接用探針與細胞或組織切片中的核酸雜交。應用：1）觀察基因在組織中的表達

2）確定基因在染色體中的定位第四十九頁，共一百零二頁。5.菌落原位雜交（colonysituhybridization）將細菌從平板轉移到NC膜上

裂解細菌釋出DNA

烘干

雜交

第五十頁，共一百零二頁。（四）核酸雜交的應用在醫(yī)學研究與實踐中，核酸雜交主要用于基因診斷。

1、遺傳病的診斷：例：β-地中海性貧血的檢驗

2、病原體的鑒定：例：結合桿菌的快速鑒定3、癌基因點突變分析4、用于骨髓移植與器官移植時的組織配型及親子鑒定第五十一頁，共一百零二頁。附：蛋白免疫雜交（一）蛋白質的免疫印跡（western)場所：硝酸纖維素膜待檢分子：蛋白探針：抗體雜交的方式：經電泳分離不同的蛋白，轉印到硝酸纖維素膜上，用特定的抗體與蛋白雜交，檢測特定的蛋白。第五十二頁，共一百零二頁。（二）所用抗體1、一抗：針對待測分子的抗體2、二抗：針對一抗的抗體，標記有放射性同位素或生物素第五十三頁，共一百零二頁。（三）操作過程蛋白的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同的蛋白質第五十四頁，共一百零二頁。蛋白印跡封閉+陽極-陰極多孔墊片濾紙凝膠載體第五十五頁，共一百零二頁。雜交（一抗與特定蛋白結合）漂洗去除多余的一抗二抗與一抗結合漂洗去多余的二抗結果檢測第五十六頁，共一百零二頁。第二節(jié)核酸的測序技術第五十七頁，共一百零二頁。一、Sanger雙脫氧終止法

(chain-terminatormethod)第五十八頁，共一百零二頁。原理

在模板指導下，聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延長，合成出新的互補的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結尾的一系列長短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA的核苷酸序列。第五十九頁，共一百零二頁。Sanger雙脫氧鏈終止法第六十頁，共一百零二頁。1.雙脫氧終止法測序反應體系包括：DNA聚合酶單鏈DNA模板帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物Mg2+4種dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP)4種ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)第六十一頁，共一百零二頁。2.Sanger法DNA測序的試劑①引物：通常由20-23個堿基構成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結構②模板③DNA聚合酶④2′，3′-雙脫氧核苷三磷酸（2′,3′-dideoxynucleosidetriphosphate,ddNTP

）⑤dNTP第六十二頁，共一百零二頁。3.測序反應的種類①引物標記法(Dyeprimerreactions)②終止物標記法(Dyeterminatorreactions)第六十三頁，共一百零二頁。Dyeprimerreactions-fluorescentdye(label)ontheprimer,onespecificdyeforeachnucleotidetobeidentified(A,C.G,T)-fourseparatereactionscoupleeachspecificprimerwiththecorrespondingddNTP第六十四頁，共一百零二頁。Thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide(noticetheHatomattachedtothe3'carbon).AlsodepictedinthisfigurearetheingredientsforaSangerreaction.Noticethedifferentlengthsoflabeledstrandsproducedinthisreaction.

第六十五頁，共一百零二頁。Thisfigureisarepresentationofanacrylamidesequencinggel.NoticethatthesequenceofthestrandofDNAcomplementarytothesequencedstrandis5'to3'ACGCCCGAGTAGCCCAGATTwhilethesequenceofthesequencedstrand,5'to3',isAATCTGGGCTACTCGGGCGT

第六十六頁，共一百零二頁。第六十七頁，共一百零二頁。Dyeterminatorreactions-theprimerisnotlabeledwithadye-thedyeisattachedtothedideoxynucleotide,sowheneveraddNTPisaddedbythepolymerase,thefragmentislabeledaccordingtotheddNTPattheend-sincelabelingoccurswiththeadditionoftheddNTP,onlyonereactionpertemplateisneeded第六十八頁，共一百零二頁。第六十九頁，共一百零二頁。第七十頁，共一百零二頁。第七十一頁，共一百零二頁。第七十二頁，共一百零二頁。第七十三頁，共一百零二頁。二、Maxam-Gilbert化學修飾法

(chemicalcleavagemethod)一、原理AsegmentofDNAislabeledatoneendwith32P.ThelabeledDNAisdividedintofoursamplesandeachsampleistreatedwithachemicalthatspecificallydestroysoneortwoofthefourbasesintheDNA.TheconditionsofthereactionarecontrolledsothatonlyafewsitesarenickedinanyoneDNAmolecule.Whenthesenickedmoleculesaretreatedwithpiperidine,theDNAbackbonesisbrokenatthesiteatwhichthebasehadbeendestroyed.Thisgeneratesaseriesoflabeledfragments,thelengthofwhichdependonthedistanceofthedestroyedbasefromthelabeledend.ThesetsoflabeledfragmentsobtainedfromeachofthefourreactionsarerunsidebysideonanacrylamidegelthatseparatesDNAfragmentsaccordingtosize.第七十四頁，共一百零二頁。原理

一個末端標記的DNA片段在4組互相獨立的化學反應中分別得到部分降解，其中每一組反應特異的針對某一種或某一類堿基。因此生成4種放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應所針對的堿基在原DNA全片段上位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。第七十五頁，共一百零二頁。基本步驟

第一步，對特定堿基（或特定類型的堿基）進行化學修飾；第二步，修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基5和3的磷酸二酯鍵斷裂；第三步，比較G、A+G、C+T、C和A>C各個泳道，可從測序凝膠的放射自顯影片上讀取DNA序列。第七十六頁，共一百零二頁。DNA化學裂解反應體系反應體系修飾試劑修飾反應鏈斷裂試劑斷裂點G硫酸二甲酯（DMS）G甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G和AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C和TC肼（加鹽）C六氫吡啶C第七十七頁，共一百零二頁。Maxam-Gilbert化學修飾法第七十八頁，共一百零二頁。特點重現(xiàn)性好，所用試劑簡單，易于掌握；所測長度比Sanger法短一些，對放射性標記末端250個核苷酸以內的DNA序列效果較好；序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應所生成的拷貝；可對合成的寡核苷酸進行測序，用以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，通過化學保護及修飾干擾實驗來研究DNA的二級結構及蛋白質-DNA相互作用。第七十九頁，共一百零二頁。無需延伸反應及克隆更適于含有稀有堿基或GC含量高及短鏈寡核苷酸的測序，可雙向標記并測序。比較繁瑣費時，過長序列有困難。

第八十頁，共一百零二頁。第八十一頁，共一百零二頁。第八十二頁，共一百零二頁。第八十三頁，共一百零二頁。三、DNA測序的自動化和大規(guī)模測序①

文庫構建②轉化③培養(yǎng)④模板制備⑤電泳檢測模板⑥測序反應⑦毛細管電泳測序⑧數(shù)據收集處理第八十四頁，共一百零二頁。第八十五頁，共一百零二頁。

第三節(jié)PCR技術

第八十六頁，共一百零二頁。

多聚酶鏈式反應（PCR：PolymeraseChainReaction)

第八十七頁，共一百零二頁。基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增第八十八頁，共一百零二頁。PCR技術的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。第八十九頁，共一百零二頁。KaryB.Mullis（1944－）第九十頁，共一百零二頁。三篇重要論文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermo