內(nèi)容教案cdna合成

為了準確地進行表達量分析，必須滿足只有cDNA作為模板檢出的先決條件，但TotalRNA中常?；煊薪MDNA，并可以直接作為PCR反應(yīng)的模板進行擴增，因此會造成解析結(jié)果確。為了避免這種情況發(fā)生，通常將檢測用引物設(shè)計在內(nèi)含子前后的外顯子上，使組DNA得不到擴增。但是，此方方法。在這種情況下，我們常常需要對TotalRNA樣品進行DNaseI處理，以除去殘存的組DNA。而DNaseI處理通常要進行復雜的純化操作，同時會造成RNA的降解和損失。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser是可以除去組DNA進行RealTimeRT-PCR反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄試劑。Kit中使用了具有較強DNA分解活性的gDNAEraser，通過42℃，2min即可除去組DNA。同時由于反轉(zhuǎn)錄試劑中含有抑制DNA的組分，經(jīng)過gDNAEraser以直接進行15min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，因此，20分鐘內(nèi)即可迅速完成從組DNA去除到cDNA合成使用本制品合成的cDNA適用于SYBR?Green分析法和TaqMan?探針分析法，可以根據(jù)實驗目的，選擇與SYBR?PremixExTaqTMII（PerfectRealTime）、PremixExTaqTM（PerfectRealTime）等TaKaRaPerfectRealTime系列定量試劑組合使用。制品內(nèi)容（20l反應(yīng)×100次gDNA 5×gDNAEraser PrimeScript?RTEnzymeMix 5×PrimeScript?Buffer2（forReal RTPrimer RNase 1ml×2EASYDilution（forRealTime 1*15×gDNAEraserBuffer在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前使用，請務(wù)必進行組DNA的除去反應(yīng)*2含有RNaseInhibitor*3含有dNTPMixture*4含有OligodTPrimer和Random6mers*5制作標準曲線時梯度稀釋cDNA或RNA品的稀釋液。模板DNA或RNA如果用水或TEBuffer稀釋時，由于受Microtube吸附作用等的影響，往往不能準確地進行稀釋，導致實驗結(jié)果精度降的標準曲線。EASYDilution也可以單獨（TaKaRaCode：D9160）。EASYDilution與本公RealTimePCR劑組合使用，對于其他公司的同類制品的適用性本公 存：-20℃特長含有去除組DNA的gDNAEraser，只需2min即可除去組DNA只需15min即可高效合成RealTimePCR反應(yīng)用模板cDNA，是進行2StepRealTimeRT-PCR反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄引物使用了Random6mers和OligodTPrimer混合的RTPrimerMix，可以均勻合成樣品中的各種cDNA。本制品提供了SYBRGreen分析法和TaqMan探針分析法各自最適反應(yīng)體系，可以根據(jù)分析方法選擇制品中附加了標準曲線制作用稀釋液EASYDilution（forRealTimePCR），將TotalRNA或cDNA稀RNA樣品本制品是將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的試劑。RNA的純度會影響cDNA的合成量，而RNA的關(guān)鍵是要抑制細胞中的RNA分解酶和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。因此，在實驗中必須采取以下措施：戴干凈手套；使用RNA操作實驗臺；在操作過程中避免等等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。（1）干熱滅菌（180℃，60（2）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下處理12小時。然后在120℃下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。實驗用于RNA實驗的試劑，需使用干熱滅菌（180℃，60min）或用上述方法進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可使用RNA實驗用的塑料容器），使用的無菌水需用0.1%的DEPC處理后進行高【方法使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足于RT-PCR反應(yīng)的RNA（只需少量的RNA便可進行RT-反應(yīng)。但為了保證實驗的成功率，建議使用GTC法（異硫酸胍法）的高純度RNA。從培養(yǎng)細胞、組織中提取時，使用RNAisoPlus（TaKaRaCode:D9108）。當同時需要進行數(shù)次反應(yīng)時，應(yīng)先配制各種試劑的混合液（MasterMix；其中包括RNasedH2O、gDNAEraser和PrimeScript?RTEnzymeMixI在使用前要地離心收集到反應(yīng)管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時應(yīng)慢慢吸取。同時，要使用精確、量程適合的移液槍，并且不要5×gDNAEraserBuffer和5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）在使用前需Vortex輕輕離心將得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的RealTimePCR反應(yīng)體系中，其加入量不要超過RealTime反應(yīng)體積的1/10（V/V）量【SYBR?GreenAssay①組DNA的除去反應(yīng)5×gDNAEraserBuffergDNAEraser2.01.0TotalRNaseupto10②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

2min（或者室溫5min*2）制MasterMix，然后再分裝到每個反應(yīng)管中*3。5×PrimeScript?Buffer2（forReal4.0PrimeScript?RTEnzymeMixIRTPrimerMix*41.01.010.0RNaseupto20 15 5*120μl應(yīng)體系可最大1μg的TotalRNA*2室溫反應(yīng)時，可以延長至30鐘*3不配制MasterMix，向①的反應(yīng)液中添加試劑時要先加入RNasedH2O和5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)，混合后再添加RTPrimerMix、PrimeScriptRTEnzymeMixI，輕輕混*4使用RTPrimerMix可以高效合成cDNA。因為實驗目的不同，也可以不使用RTPrimerMix，而選擇OligodTPrimer或GeneSpecificPrimer進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，引物使用量如下：OligodTPrimer50pmol／20μl反應(yīng)GeneSpecificPrimer5pmol／20μl反應(yīng)反轉(zhuǎn)*6使用GeneSpecificPrimer時，建議反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置為42℃15min。PCR反應(yīng)有非特異性擴增時，將溫度升到50℃會有所改善。*7合成的cDNA請于-20【TaqMan?ProbeAssay①去除組DNA反應(yīng)5×gDNAErasergDNA2.01.0TotalRNaseupto10 2min（或者室溫5min*2）②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制MasterMix，然后再分裝到每個反應(yīng)管中*3。5×PrimeScript?Buffer2（forReal4.0PrimeScript?RTEnzymeMix1.0RTPrimerMix4.010.0RNaseupto20 15 5*120μl應(yīng)體系可最大2μg的TotalRNA*2室溫反應(yīng)時，可以延長至30鐘*3不配制MasterMix，向①的反應(yīng)液中添加試劑時要先加入RNasedH2O和5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)，混合后再添加RTPrimerMix、PrimeScriptRTEnzymeMixI，輕輕混*4使用RTPrimerMix可以高效合成cDNA。因為實驗目的不同，也可以不使用RTPrimerMix，而選擇OligodTPrimer或GeneSpecificPrimer進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，引物使用量如下：OligodTPrimer50pmol／20μl反應(yīng)GeneSpecificPrimer5pmol／20μl反應(yīng)反轉(zhuǎn)*6使用GeneSpecificPrimer時，建議反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置為42℃15min。PCR反應(yīng)有非特異性擴增時，將溫度升到50℃會有所改善。*7合成的cDNA請于-20RealTimePCR反應(yīng)。以下是使用本制品進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，選擇SYBR?PremixExTaqTMII（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR081）進行RealTimePCR反應(yīng)的采用TaqMan?探針法進行檢測時，請選擇PremixExTaqTM（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR039）。應(yīng)用ThermalCyclerDice?RealTimeSystem請按照ThermalCyclerDice?RealTimeSystem（TaKaRaCode：TP800）的使用說明書要求驗操①按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請在冰上進行SYBR?PremixExTaqTM12.5PCRForwardPrimer（10μM）PCRReversePrimer（10μM）RT反應(yīng)液（cDNA溶液）dH2O（滅菌蒸餾水1.01.028.50.40.4μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度*2建議在25μl反應(yīng)液中使用相當于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA為模板。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的加入量過PCR反應(yīng)液總體積的10%。②進行RealTimePCR建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應(yīng)程序。退火/延伸時間可在20～30秒范圍內(nèi)進行調(diào)整，推薦使用30秒的條件。由于使用TmPCR試進行三步法PCR擴增反應(yīng)。兩步法PCRStage1：預變性95℃30Stage2：PCR95℃5 30-60秒Stage*使用SYBR?GreenI時進行aaaExaqSaotttDAtSa用NC9℃、15RR反應(yīng)前進行模板的預變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。③實驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后確認RealTimePCR的擴增曲線和融解曲線（使用SYBR?GreenI時），進行PCR定量時制作AppliedBiosystems書要求進行實驗①按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請在冰上進行SYBR?PremixExTaqTMII（2×）PCRForwardPrimer（10μM）PCRReversePrimer（10μM）ROXReferenceDyeorDyeII（50×）*3RT反應(yīng)液（cDNA溶液）dH2O（滅菌蒸餾水10250.820.40.820.40.41246162050*1常引物終濃度為0.4μM以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時0.2～1.0μM圍內(nèi)調(diào)整引*2建議在20μl反應(yīng)液中使用相當于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA為模板。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的加入量過PCR反應(yīng)液總體積的10%。*3ROXReferenceDyeII（50×）比ROXReferenceDye（50×）濃度低，使用7500Real-TimePCRSystem和7500FastReal-TimePCRSystem時，請使用ROXReferenceDyeII（50×）。與使用ROXReferenceDye（50×）相比，校正后的熒光信號值高，但解析結(jié)果完全相同。使用ABIPRISM7000/7700/7900HT及7300Real-TimePCRSystem時，請使用ROXReferenceDye（50*496孔板、Single-Tube、8聯(lián)Tube采用50μl反應(yīng)體系，384孔板、96-wellFastThermalCyclingte采用20μl反應(yīng)體系。②進行RealTimePCR建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應(yīng)程序，如果該程序得不到良好的實驗結(jié)果時，再進行PCR條件的優(yōu)化。由于使用Tm值較低的引物等原因，兩步法PCR反應(yīng)擴增性能較差時，可以嘗試進行三步法PCR擴增反應(yīng)。兩步法PCRStage1：預變性95℃30Stage2：PCR反應(yīng)95℃560℃30～34秒*Dissociation*使用77007900HT時請設(shè)定在30秒。使用7000和7300時請設(shè)定在31秒。使用7500時請設(shè)定在34秒。本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗體的HotStart用DNA聚合酶，與其他公司的化學修飾型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR95℃、5～15溫處理時間過長，會使酶的活性下降，其PCR的擴增效率、定量精度等都會受到影響。如果在PCR反應(yīng)前進行模板的預變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。③實驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后確認RealTimePCR的擴增曲線和融解曲線（使用SYBR?GreenI時），進行PCR定量時制TotalRNA中混 組DNA的去除效果驗使用提取的MouseLiverRNA2μg進行g(shù)DNAEraser添加（+）/不添加（-）實驗后，再進行RTase不加的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以確認TotalRNA中組DNA的殘存量。每個反應(yīng)做3個復孔RealTimePCR反試劑： SYBR?PremixExTaqTM（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR041）模板： 上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl 25Target Mouse 使用TaKaRaRealTimePCR用引物數(shù)據(jù)庫中的引物反應(yīng)條件 ThermalCyclerDice?RealTimeSystem標準反應(yīng)條RealTimePCR擴增曲線圖如下：從以上擴增曲線結(jié)果可以看出，TotalRNA經(jīng)過gDNAEraser處理后，沒有檢測到組DNA的殘留cDNA合成量比較試劑 DRR047A；PrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealDRR037A；PrimeScript?RTreagentKit（PerfectRealTime）模板： MouseLiver來源TotalRNA2pg-2μg以及滅菌水反應(yīng)體積 20RT RTPrimer 各Kit推薦的反應(yīng)條RealTimePCR反試劑： SYBR?PremixExTaqTM（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR041）模板： 上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl 25Target Mouse 使用TaKaRaRealTimePCR用引物數(shù)據(jù)庫中的引物反應(yīng)條件 ThermalCyclerDice?RealTimeSystem標準反應(yīng)條StandardY=－3.425×LOG（X）+Y=－3.429×LOG（X）+從以上實驗結(jié)果可以看出，使用PrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，與TaKaRa深受好評的現(xiàn)有制品DRR037同樣，可獲得高質(zhì)量的RealTimePCR用cDNA。進行RealTi