生化實驗質(zhì)粒DNA提取

生化實驗質(zhì)粒DNA提取第一頁，共四十三頁，2022年，8月28日實驗背景1、質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小為1KB~200KB2、大多數(shù)來自于細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。3、其復(fù)制和遺傳獨立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。第二頁，共四十三頁，2022年，8月28日2、嚴(yán)瑾型質(zhì)粒：嚴(yán)瑾型質(zhì)粒的復(fù)制需要一個質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過氯毒素等蛋白合成抑制劑來增加。第三頁，共四十三頁，2022年，8月28日質(zhì)粒類型質(zhì)粒按復(fù)制方式可以分為兩種類型：1、松弛型質(zhì)粒：松弛性質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶，即使蛋白質(zhì)合成受到抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依舊進行。第四頁，共四十三頁，2022年，8月28日質(zhì)粒的應(yīng)用1、大多數(shù)基因工程使用的是松弛型質(zhì)粒2、嚴(yán)瑾型質(zhì)粒用來表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。3、質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為外源基因進入細(xì)菌中擴增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因工具在基因過程中具有極其廣泛的應(yīng)用價值。第五頁，共四十三頁，2022年，8月28日質(zhì)粒的性質(zhì)中與載體作用關(guān)系密切的包括：1、質(zhì)粒的復(fù)制型

2、質(zhì)粒的不相容性3、質(zhì)粒的接合性4、多克隆位點

5、篩選標(biāo)記第六頁，共四十三頁，2022年，8月28日1、質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳，并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是比病毒更簡單的原始生命。質(zhì)粒通過細(xì)菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體，是細(xì)菌有性繁殖的性因子，1952年由Lederburg正式命名為質(zhì)粒。第七頁，共四十三頁，2022年，8月28日質(zhì)粒特點質(zhì)粒對細(xì)菌本身的生長繁殖不是必需的，但可以賦予細(xì)菌一定的表型，如抗藥性等。

它是基因操作工程中常用工具中載體的一種。是攜帶目的DNA片段進入受體細(xì)胞進行擴增和表達(dá)的工具。第八頁，共四十三頁，2022年，8月28日人工基因工程獲得胰島素首先獲得胰島素基因，再將胰島素基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)，再創(chuàng)造大腸桿菌增殖的有利環(huán)境，對大腸桿菌進行大規(guī)模培養(yǎng)，使之產(chǎn)生大量的治療糖尿病的藥物--胰島素，提取純化。第九頁，共四十三頁，2022年，8月28日分離質(zhì)粒DNA的方法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA的方法眾多，目前常用的有:1、堿裂解法2、煮沸法3、SDS法4、羥基磷灰石層析法……第十頁，共四十三頁，2022年，8月28日這幾種方法概括起來說主要采用非離子型或離子型去污劑，有機溶劑或堿進行處理及加熱處理所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括三個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA第十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日選擇哪一種方法取決于以下幾個因素：1、質(zhì)粒的大小2、大腸桿菌菌株3、裂解后用于純化的技術(shù)和實驗要求第十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日各種方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟且回收效率高，提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切，連接和轉(zhuǎn)化。第十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日質(zhì)粒DNA的提取第十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日實驗?zāi)康?/p>

掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各主要試劑的作用。第十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日質(zhì)粒(plasmid)共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA；

能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。實驗原理第十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日質(zhì)粒的復(fù)制類型

嚴(yán)瑾型:只在細(xì)胞周期的一定階段進行復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)胞內(nèi)只有1-2個質(zhì)粒。

松弛型:質(zhì)粒在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制，當(dāng)染色體復(fù)制停止后，質(zhì)粒仍然能繼續(xù)復(fù)制，每個細(xì)胞中含有10-200個拷貝。第十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日載體(Vector)能自主復(fù)制；有克隆位點(外源DNA插入點)，常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記，便于重組體的篩選和鑒定；分子量小，以容納較大的外源DNA.第十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日質(zhì)粒提純思路質(zhì)粒的特性：共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白質(zhì)、基因組DNA、RNA

堿裂解法堿裂解抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。第十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日實驗原理分析

堿性條件變性

質(zhì)粒DNA染色體DNA第二十頁，共四十三頁，2022年，8月28日堿裂解法在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。第二十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日1.手工堿裂解法抽提質(zhì)粒5MKAC酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS和染色體DNA沉淀50mM葡萄糖,Tris·HCl(25mM,pH8.0),10mMEDTA分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活0.2MNaOH,1%SDS堿性水解細(xì)胞壁肽聚糖，核酸和蛋白質(zhì)變性無水乙醇:除去DNA水化層，沉淀DNATE

(Tris

+EDTA)緩沖液:溶解DNA平衡酚:氯仿:異戊醇=25:24:1氯仿使蛋白質(zhì)變性并分離水相與有機相。平衡酚使DNA在上清中(pH=7.8,酸性下DNA位于有機相，酚的密度大)。異戊醇可消除出現(xiàn)的泡沫。第二十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解細(xì)菌離心取上清

(含質(zhì)粒DNA)柱吸附(預(yù)處理柱)PW漂洗PD洗滌去蛋白EB溶解DNA質(zhì)粒DNA溶液2.質(zhì)粒提取試劑盒(離心柱型)最后低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅膠膜上洗脫。第二十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日第二十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日實驗器材和試劑實驗器材超凈工作臺、恒溫?fù)u床、臺式離心機、高壓滅菌鍋、1.5mL離心管、加樣槍、離心吸附柱、廢液收集管第二十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日試劑1.含有質(zhì)粒pCDA3.1的大腸桿菌DH5a2.LB液體培養(yǎng)基3.平衡液BL4.STE緩沖液(溶液P1)5.裂解液(溶液P2)6.NaAc溶液(3M,pH4.8)(溶液P3)7.去蛋白液PD8.漂洗液PW9.洗脫緩沖液EB10.RNaseA(10mg/mL)第二十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日溶液1：懸浮細(xì)胞，抑制DNASE溶液1:50mM葡萄糖25mMTris-HCL(PH=8.0)10mMEDTA(PH=8.0)葡萄糖：增加溶液的粘度，懸浮菌體，避免快速沉淀，維持滲透壓，防止DNA受機械作用力而降解。EDTA:金屬螯合劑，螯合Mg2+、Ca2+等二價金屬離子，抑制Dnase對DNA的降解作用Dnase:脫氧核糖核酸酶它發(fā)揮作用時需要金屬離子做輔基第二十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日溶液2：裂解細(xì)菌，變性DNA和少量蛋白質(zhì)溶液2（新鮮配制）：0.2MNaOH1%SDSNaOH:破解細(xì)胞（瞬間溶解細(xì)胞膜，細(xì)胞膜發(fā)生從雙層膜結(jié)構(gòu)到微囊結(jié)構(gòu)的變化），釋放DNA，使蛋白質(zhì)變性。DNA在5<PH<9的溶液中是穩(wěn)定的，但當(dāng)PH<3或PH>12時，就會引起雙鏈之間的氫鍵解離而變性。溶液2中的NaOH的濃度為0.2M，加到提取液中時，該系統(tǒng)的PH>12，因而促使染色體DNA和質(zhì)粒DNA的變性。為什么要新鮮配制？為什么采用NaOH?第二十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日SDS：是一種離子型表面活性劑，其主要功能是溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白，破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核蛋白；SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來，為后續(xù)處理需要。注意：1、處理時間不能過長；否則堿性條件下基因組DNA會慢慢斷裂2、溫柔混合；避免機械剪切導(dǎo)致已經(jīng)變性的基因組DNA斷裂SDS:十二烷基硫酸鈉第二十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日溶液3：是大部分蛋白質(zhì)和細(xì)菌基因組DNA沉淀溶液3（PH=4.8）：0.5M60mlKAC11.5ml冰醋酸28.5ml水本質(zhì)上是KAC-HAC的緩沖液；用PH=4.8的溶液3是為了把強堿性的提取液調(diào)回至PH中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性并穩(wěn)定存在第三十頁，共四十三頁，2022年，8月28日KAC：SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合，SDS能與KAC生產(chǎn)PDS，PDS的溶解度要比SDS低得多，從而使大部分的蛋白質(zhì)與細(xì)菌基因組DNA一起沉淀，使沉淀更完全。另外可以中和核酸上的電荷，減小相斥力，有利于變性的大分子染色體DNA、RNA互相聚合而沉淀下來。為何加入溶液3之后出現(xiàn)大量的沉淀？這沉淀的本質(zhì)是什么？這里還需把SDS除掉的原因是？第三十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日酚/氯仿/（異丙醇）：抽提去除蛋白酚：使蛋白質(zhì)變性氯仿：水飽和酚比重略比水重，遇到高濃度鹽，離心后酚想轉(zhuǎn)移至上層，不利于含質(zhì)粒水相的回收，加入氯仿可增重其比重，使酚-氯仿始終在下層，另外避免酚進入水相。異丙醇：讓離心后上下層的界面更清晰，方便水相的回收為何不加氯仿，酚會大量進入水相？第三十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日無水乙醇：沉淀質(zhì)粒DNA乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇和核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的DNA沉淀劑DNA溶液中DNA是以水和狀態(tài)穩(wěn)定存在的，當(dāng)加入乙醇的時候，乙醇會奪取DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合RNaseA：使RNA降解，減少提取得到的質(zhì)粒DNA中的RNA，以便減少對后續(xù)實驗的影響。為何要用無水乙醇,加入兩倍體積無水乙醇后，乙醇含量就變?yōu)榱?7%,，用95%的乙醇可不可以，無水乙醇的價格要比95%的乙醇價格要貴得多第三十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日實驗步驟1、

細(xì)菌培養(yǎng)：將含有pQE30質(zhì)粒的大腸埃希菌接種到TG110uL接種到10ml含氨芐西林(100μg/mL)的LB培養(yǎng)液中，37℃搖培過夜(10-12h).2、收集菌體：取1.5mL菌液轉(zhuǎn)入離心管中↓10000rpm，1min棄上清。將離心管倒置于紙巾上，以盡量去除上清第三十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日3.懸浮細(xì)菌：將細(xì)菌沉淀重懸于100ul用冰預(yù)冷的溶液p1中，渦旋震蕩，徹底懸浮細(xì)菌沉淀。注意：細(xì)胞懸液必須懸浮均勻，無可見沉淀塊，否則所提質(zhì)粒DNA的純度及所得率會大大降低。4.堿液裂解細(xì)菌：加200uL新配制的溶液P2，立即輕柔顛倒離心管6-8次。使管內(nèi)內(nèi)容物混勻，禁止劇烈振蕩。置冰浴中放置2min。5.中和與復(fù)性：加150uL用冰預(yù)冷的溶液P3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次。，使溶液p3在黏稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，隨后置冰浴中5min第三十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日6.離心沉淀：↓12000rpm,5min將含質(zhì)粒DNA的上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中

7.去蛋白：加等體積酚-氯仿，劇烈振蕩混勻，靜置3min待其分層后，↓12000rpm,10min，將上層液體轉(zhuǎn)入到另外一離心管中8、

乙醇沉淀質(zhì)粒DNA：加入2倍體積的無水乙醇，震蕩混合，靜置5min使質(zhì)粒DNA形成沉淀。↓12000rpm,10min,收集質(zhì)粒DNA沉淀，棄上清液為何要2倍體積的無水乙醇第三十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日9.乙醇洗鹽:質(zhì)粒DNA沉淀里有一定量的鹽分需要除去。加入1ml70%乙醇，輕緩搖動數(shù)次，↓12000rpm,2min,棄上清液10.溶解質(zhì)粒DNA：

待殘余乙醇揮發(fā)干凈后，加30ulTE緩沖液(PH8.0）溶解沉淀，加2ulRaseA(10mg/ml),37度保溫30min以去除RNA。所得質(zhì)粒粒DNA置-20度保存?zhèn)溆?。實驗是不是還有缺陷，其中RNseA怎么除掉為何要加TE緩沖液，有什么好處？第三十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日DNA的保存1、短期貯存：4℃或-20℃存放于TE緩沖液中。TE緩沖液的pH與DNA貯存有關(guān)，pH=8,可減少DNA脫氨反應(yīng)，pH<7.0,DNA容易變性。2、長期貯存：-70℃存置于TE緩沖液中,在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。注意:小心操作移液器，特別是在加入溶液II和III后，一定不要劇烈振蕩，以免切碎DNA(包括質(zhì)粒DNA和基因組DNA)!!!第三十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日注意事項1、在堿液裂解的那個步驟中需輕柔混合，不要劇烈振蕩，以免打亂基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組片段。此時菌液應(yīng)變得清亮黏稠，所用時間不應(yīng)該超過5min,以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌種過多，裂解不夠徹底，應(yīng)減少菌體量。2、溶液3加入后應(yīng)立即混合，以免產(chǎn)生局部沉