畢業(yè)論文水楊酸對鹽藻生長和物質(zhì)積累的影響

SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ畢業(yè)論文水酸對鹽藻生長和物質(zhì)積累的影響學院：專業(yè)：學生：學號：指導教師：20年月摘要本論文初步研究了一定濃度圍的水酸對鹽藻生長和物質(zhì)積累的影響。設置1mg/L、5mg/L、10mg/L的水酸對鹽藻的誘導，并同時給予一定的逆境脅迫條件（24h、3500Lx高光強），誘導藻細胞積累色素（主要是β-蘿卜素）。在此階段中，利用血球計數(shù)板法對藻液中細胞數(shù)目進行計數(shù)，并定期取樣進行色素和總可溶性蛋白質(zhì)含量的測定。實驗結(jié)果表明，低濃度水酸對鹽藻的生長具有一定的促進作用，1mg/L水酸溶液促進作用較明顯；高濃度水酸對鹽藻的生長有一定的抑制作用，10mg/L水酸溶液抑制作用最大。1mg/L濃度水酸能夠明顯促進色素積累，可以使用1mg/L的水酸來加快色素積累過程，從而達到增加色素產(chǎn)量的目的；鹽藻總可溶性蛋白含量的變化規(guī)律與藻細胞生長趨勢基本一致。關鍵詞：杜氏鹽藻，β-蘿卜素，水酸，可溶性蛋白。AbstractInthisthesis,somepreliminarystudyofsalicylicacidconcentrationongrowthandmaterialaccumulation.Set1mg/L,5mg/L,10mg/Lofsalicylicacidonsaltinducedalgae,AndalsogivesomeStressconditions(24h,3500Lxhighlightintensity),Inducedaccumulationofalgalcellpigment(mainlyβ-carotene),Inthisstage,Platemethodusingbloodcellcountsonthenumberofalgalcellsinfluidwerecounted,Andperiodicsamplingforpigmentandsolubleproteincontent.TheresultsshowthatLowconcentrationsofsalicylicacidonthegrowthofDunaliellahasaroleinpromoting,1mg/Lsalicylicacidtopromotetheroleofthemoreobvious;HighconcentrationsofsalicylicacidonthegrowthofDunaliellahassomeinhibitoryeffect,10mg/Lsalicylicacidinhibitedthemost.1mg/Lconcentrationofsalicylicacidcouldpromotetheaccumulationofpigment,youcanuse1mg/Lofsalicylicacidtospeeduptheprocessofpigmentaccumulation,Increaseinpigmentproductiontoachievethegoal;Totalsolubleproteincontentofcellularchangesofcellgrowthandthesametendency.Keywords：Dunaliella、β-carotene，SA，Solubleprotein目錄TOC\o"1-4"\h\z\u\l"_Toc295399871#_Toc295399871"摘要 I\l"_Toc295399872#_Toc295399872"Abstract II\l"_Toc295399873#_Toc295399873"目錄 III\l"_Toc295399874#_Toc295399874"第一章引言 1\l"_Toc295399875#_Toc295399875"1.1課題的背景和意義 1\l"_Toc295399876#_Toc295399876"1.2β-蘿卜素 1\l"_Toc295399877#_Toc295399877"1.2.1物理化學性質(zhì) 1\l"_Toc295399878#_Toc295399878"1.2.2β-蘿卜素的來源 2\l"_Toc295399879#_Toc295399879"化學合成法 2\l"_Toc295399880#_Toc295399880"天然物提取物 2\l"_Toc295399881#_Toc295399881"微生物發(fā)酵法 3\l"_Toc295399882#_Toc295399882"1.2.3β-蘿卜素的生理功能及應用前景 4\l"_Toc295399883#_Toc295399883"β-蘿卜素的生理功能 4\l"_Toc295399884#_Toc295399884"β-蘿卜的應用前景 5\l"_Toc295399885#_Toc295399885"1.3利用杜氏鹽藻生產(chǎn)β-蘿卜素 6\l"_Toc295399886#_Toc295399886"1.3.1杜氏鹽藻形態(tài)及分類學特征 6\l"_Toc295399887#_Toc295399887"1.3.2杜氏鹽藻的培養(yǎng)以及外界條件對β-蘿卜素積累的影響 6\l"_Toc295399888#_Toc295399888"杜氏鹽藻的培養(yǎng) 6\l"_Toc295399889#_Toc295399889"環(huán)境因子的影響 7\l"_Toc295399890#_Toc295399890"1.3.3杜氏鹽藻的應用現(xiàn)狀 8\l"_Toc295399891#_Toc295399891"1.4外源激素水酸與杜氏鹽藻的β-蘿卜積累 10\l"_Toc295399892#_Toc295399892"1.4.1水酸的性質(zhì) 10\l"_Toc295399893#_Toc295399893"1.4.2水酸的生理作用 10\l"_Toc295399894#_Toc295399894"1.4.3水酸的應用 11\l"_Toc295399895#_Toc295399895"1.4.4水酸與β-蘿卜素 12\l"_Toc295399896#_Toc295399896"第二章材料與方法 13\l"_Toc295399897#_Toc295399897"2.1杜氏鹽藻的培養(yǎng) 13\l"_Toc295399898#_Toc295399898"2.1.1藻種 13\l"_Toc295399899#_Toc295399899"2.1.2藻種培養(yǎng) 13\l"_Toc295399900#_Toc295399900"2.2實驗材料 13\l"_Toc295399901#_Toc295399901"2.2.1藥品與試劑 13\l"_Toc295399902#_Toc295399902"2.2.2儀器 14\l"_Toc295399903#_Toc295399903"2.3實驗方法 14\l"_Toc295399904#_Toc295399904"2.3.1水酸的配置 14\l"_Toc295399905#_Toc295399905"2.3.2鹽藻的誘導 14\l"_Toc295399906#_Toc295399906"2.3.3實驗培養(yǎng)條件 15\l"_Toc295399907#_Toc295399907"2.3.4鹽藻細胞生長的測定 15\l"_Toc295399908#_Toc295399908"2.3.5鹽藻細胞的收集 15\l"_Toc295399909#_Toc295399909"2.3.6鹽藻色素含量的測定 15\l"_Toc295399910#_Toc295399910"2.3.7鹽藻總可溶性蛋白含量的測定 16\l"_Toc295399939#_Toc295399939"第三章結(jié)果與討論 18\l"_Toc295399940#_Toc295399940"3.1鹽藻細胞生長曲線 18\l"_Toc295399941#_Toc295399941"3.1.1細胞形態(tài)的觀察 18\l"_Toc295399942#_Toc295399942"3.1.2鹽藻細胞生長的測定 19\l"_Toc295399943#_Toc295399943"3.1.3鹽藻細胞生長的討論 20\l"_Toc295399944#_Toc295399944"3.2鹽藻色素含量 21\l"_Toc295399945#_Toc295399945"3.2.1色素含量的測定 21\l"_Toc295399946#_Toc295399946"3.2.2色素含量的討論 21\l"_Toc295399947#_Toc295399947"3.3蛋白標準曲線的制作 22\l"_Toc295399962#_Toc295399962"3.4鹽藻總可溶性蛋白 23\l"_Toc295399963#_Toc295399963"3.4.1總可溶性蛋白含量的測定 23\l"_Toc295399964#_Toc295399964"3.4.2總可溶性蛋白含量的討論 23\l"_Toc295399965#_Toc295399965"第四章結(jié)論 25\l"_Toc295399966#_Toc295399966"參考文獻 26\l"_Toc295399967#_Toc295399967"致謝 28\l"_Toc295399968#_Toc295399968"附錄 29第一章引言1.1課題的背景和意義鹽藻（DunaliellaSalina）是重要的經(jīng)濟藻類之一，β-蘿卜素累積量可達干重的0.4％～10%。高產(chǎn)品系在特定條件下累積β-蘿卜素的量最高可達細胞干重的10%以上[1]，其本身不僅是維生素A的前體和食品加工業(yè)的天然色素，而且還能防治癌癥、腫瘤和心血管疾病以及老年性癡呆和白障等與年齡有關的退化性疾病，是非常重要的保健品，具有合成色素不可替代的重要商業(yè)價值；鹽藻富含蛋白質(zhì)（40%），其氨基酸組成與植物蛋白相近，是人類的理想食品和名貴水產(chǎn)鮑魚、甲魚、蝦、貝類等幼體的優(yōu)質(zhì)餌料。目前全世界β-蘿卜素的需求量每年以7%～9%的速度增長，美國的需求量近些年以10%～15%的速率遞增，且在歐美和日本等國都已形成市場。據(jù)報道，全世界β－蘿卜素的年需求量在1000t左右，在我國其年銷售量約為4～5噸，其需求基本上從國外進口[2]。近幾年，杜氏藻的開發(fā)應用受到人們越來越多的關注,它不但在食品保健、醫(yī)藥制品等方面得到開發(fā)利用,而且在化妝品、飼料等方面也受到人們的青睞,作為生物技術或基因工程的受體在科研上也有了一席之地。在石油地質(zhì)研究領域,認為藻類是烴源巖的主要母質(zhì)來源之一,已被越來越深入地研究和應用。所以，鹽藻培養(yǎng)與開發(fā)利用意義重大。但在鹽藻培養(yǎng)過程中，各種培養(yǎng)條件均會影響鹽藻的生長和其體的物質(zhì)積累，而關于外源激素水酸的作用未見報道。本論文針對水酸對鹽藻生長與物質(zhì)積累的調(diào)控作用，為鹽藻的科學培養(yǎng)和其作為一種新型生物反應器的應用提供重要參考。本次實驗以杜氏鹽藻為材料，用不同弄濃度的水酸SA處理長勢相同的杜氏鹽藻，分析不同濃度的水酸對鹽藻色素和可溶性蛋白質(zhì)積累的影響1.2β-蘿卜素1.2.1物理化學性質(zhì)類蘿卜素通常是指40碳的碳氫化合物（蘿卜素）和它們的氧化衍生物兩大類色素的總稱。在自然界，類蘿卜素廣泛存在于動物、植物、微生物中。它們一般都具有相同的化學結(jié)構(gòu)特征，都是由8個異戊二烯單位組成的多烯鏈，由共軛雙鍵構(gòu)成的一類化合物或其氧化衍生物。類蘿卜素中最要的部分是決定其功能和顏色的共軛雙鍵系統(tǒng)。目前已發(fā)現(xiàn)600多種類蘿卜素，它們可分為四個亞族：蘿卜素，如α-、β-、γ-蘿卜素番茄紅素；蘿卜醇，如葉黃素、玉米黃素、蝦青素；蘿卜醇的衍生物，如β-阿樸-8-蘿卜酸酯；蘿卜酸，如臧紅素、胭脂樹橙等。類蘿卜素具有多種生理功能，如是重要營養(yǎng)物質(zhì)維生素A的前體，消除自由基延緩衰老，增強免疫力，防癌抗癌等作用[3]β-蘿卜素(β-carotene)是類蘿卜素的一種,又稱它為維生素A原,人體所需的維生素A有60%～70%來自于β-蘿卜素。β-蘿卜素為紅紫色至暗紅色的結(jié)晶性粉末。稀溶液呈橙黃至黃色,濃度大時呈橙紅色,因溶劑的極性可能稍帶紅色。β-蘿卜素分子式為C40H56,化學結(jié)構(gòu)式如下:圖1β-蘿卜素的結(jié)構(gòu)式1.2.2β-蘿卜素的來源β-蘿卜素的生產(chǎn)方法有化學合成法、天然物提取法、微生物發(fā)酵法3種。化學合成法化學合成法是指,通過化學合成采用有機化工原料進行的一種人工反應。化學合成法合成的β-蘿卜素為全反式構(gòu)型。目前合成β-蘿卜素主要有兩條技術路線：A.以維生素A合成過程的中間產(chǎn)物C14醛為原料將C14醛延長碳鏈成C19醛,再將兩分子C19醛由乙炔格利雅反應生成β-蘿卜素。B.以維生素A為原料將維生素A轉(zhuǎn)化成視黃醛和甲基維梯希試劑,再經(jīng)縮合而成β-蘿卜素。以前,在人們生活領域中多采用人工合成的β-蘿卜素。隨著科技的不斷發(fā)展,化學法合成的β-蘿卜素雖然純度相對較高,生產(chǎn)成本低,但容易摻入少量有致染色體突變作用的有毒化學物質(zhì),且與天然β-蘿卜素相比吸收效果差;隨著人們認識的增長,天然β-蘿卜素將在占據(jù)未來市場的主要地位。天然物提取物目前，采用萃取法、酶法從天然植物、藻類、鹽藻中提取β-蘿卜素。從天然植物中萃取β-蘿卜素的技術主要有：用有機溶劑來進行萃取和超臨界流體萃取。從鹽藻中提取β-蘿卜素的方法主要是濕法萃取即將鹽藻濃集后，進行萃取再分離回收得到β-蘿卜素。工業(yè)上采用的鹽藻有鹽生杜氏藻(D.salina)和巴氏杜氏藻(D.barolauril)。杜氏藻培養(yǎng)生產(chǎn)β-蘿卜素的條件比較苛刻，需考慮到藻類退化的問題,需大面積培養(yǎng)。目前在我國最大的吉藍鹽場,就利用地理優(yōu)勢，大面積種植鹽藻,并提取β-蘿卜素。天然植物等所含β-蘿卜的量較少，難以大量生產(chǎn)且產(chǎn)品著色力差，成本高，在現(xiàn)有市場中所占份額也較小。微生物發(fā)酵法微生物發(fā)酵法是指利用微生物培養(yǎng)技術，利用微生物在其體發(fā)酵合成β-蘿卜素，然后自微生物體分離得到β-蘿卜素的一種方法。國外微生物合成β-蘿卜素的研究主要集中在絲狀真菌(三孢布拉氏霉菌)和紅酵母[4]方面除此之外，也有杜氏鹽藻提取法、螺旋藻提取法以及基因工程法用于β-蘿卜素的生產(chǎn)研究。（1）三孢布拉氏霉發(fā)酵法三孢布拉氏霉屬于真菌，它生長速度很快且產(chǎn)生發(fā)達的菌絲。曾強松[5]在種子階段，采用正負孢子混合培養(yǎng)，促進了β-蘿卜素的積累，而這種促進方式是由兩性配合產(chǎn)生的三孢酸介導的。所以研究三孢酸類似物，如青霉素、β-紫羅酮、脫落酸等都能對β-蘿卜素產(chǎn)量的提高有很大的幫助。如果在三孢布拉霉培養(yǎng)基中加入10-4mol/L～10-3mol/L的β-紫羅酮后，β-蘿卜素的含量就會比空白時提高250%。而且要在對數(shù)生長期添加，這樣更有利于菌體產(chǎn)β-蘿卜素，添加太早或太多都會抑制β-蘿卜素的產(chǎn)量。廖春麗[6]通過響應面法優(yōu)化了β-蘿卜素液體發(fā)酵培養(yǎng)基，得到了較高的β-蘿卜素產(chǎn)量。（2）紅酵母發(fā)酵法紅酵母是一類抗逆性較強的腐生菌。紅酵母法有成本低、周期短、發(fā)酵易于控制的優(yōu)點[7]。據(jù)報道,利用高靜水壓處理過的紅酵母，通過響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，可使β-蘿卜素的產(chǎn)量達13.43mg/L。（3）螺旋藻培養(yǎng)提取法螺旋藻是一種新興的食療食物，6g螺旋藻中的β-蘿卜素含量就相當于20個雞蛋[8]。因為螺旋藻中β-蘿卜素的含量遠大于某些動植物，所以從螺旋藻中提取β-蘿卜素已經(jīng)成為目前研究的重點。（4）杜氏鹽藻提取β-蘿卜素杜氏鹽藻是一類生活在富含NaCl的水(如海洋、鹽湖、鹽池、鹽堿等)中的單細胞低等真核生物。β-蘿卜素作為鹽藻光合作用的產(chǎn)物，受生長環(huán)境的鹽度、溫度、光照射條件及磷源的影響。由于條件的影響性，采用二步法培養(yǎng)杜氏鹽藻，首先在有利于鹽藻生長的條件下培養(yǎng)，此時藻體繁殖迅速，待藻體生長成熟，再將藻體轉(zhuǎn)入不利于藻體生長但有利于積累β-蘿卜素的強光、高鹽、低氮、高溫條件下培養(yǎng)。這樣就在很大程度上提高了β-蘿卜素的產(chǎn)量。（5）基因工程法隨著轉(zhuǎn)基因技術的迅速發(fā)展，利用基因工程法產(chǎn)生的菌類生產(chǎn)類蘿卜素成為研究的熱點。近年來對其主要合成途徑的研究取得了重大進展，已從分子水平闡釋其生物合成途徑，并已初步實現(xiàn)通過遺傳工程技術改變植物和微生物中類蘿卜素的組成和含量。1.2.3β-蘿卜素的生理功能及應用前景β-蘿卜素的生理功能(1)免疫調(diào)控作用β-蘿卜素作為維生素A的前體，可轉(zhuǎn)化為維生素A而發(fā)揮免疫調(diào)控作用；蘿卜素本身也能明顯增強機體的免疫功能，并具有很強的抗氧化及抗感染作用，甚至效力更強[9]。β-蘿卜素和鹽藻提取物能促進吞噬細胞、淋巴細胞的功能，促進細胞因子釋放，具有細胞免疫刺激作用。β-蘿卜素不僅具有比維生素A更強的免疫增強作用，而且轉(zhuǎn)化為維生素A的數(shù)量可以隨著β-蘿卜素攝入量的增加而降低，即使大量服用β-蘿卜素也不會導致體維生素A水平的異常增加[10]。(2)抗氧化作用β-蘿卜素具有抑制自由基產(chǎn)生的抗氧化作用[11]。杜氏鹽藻中提取的以順式結(jié)構(gòu)為主的β-蘿卜素，能輕度降低血清中膽固酵、高密度脂蛋白-膽固酵(HDL-C)及低密度脂蛋白-膽固酵(LDL-C)的水平，提高HDI-C/TC比值。此外還能有效地抑制血清和動脈壁丙二醛的生成，且存在劑量依賴關系[12]。因此，鹽藻β-蘿卜素能預防心血管疾病及防止衰老。由于β-蘿卜素具有抗氧化作用，口服β-蘿卜素膠囊能使塵肺病人的血中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性明顯升高，因此，有利于塵肺的預防和治療。此外，由于自由基能夠?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的功能受損，而影響到學習和記憶的能力，對小鼠的實驗表明β-蘿卜素的抗氧化性能促進小鼠的學習和記憶功能[13]。(3)抗突變和抗腫瘤作用鹽藻β-蘿卜素不僅無致突變性，而且具有抗突變作用和抗腫瘤作用。馬建國等人[14]的研究表明，鹽藻β-蘿卜素能抑制γ-射線誘發(fā)的微核形成和Mit誘發(fā)的染色體畸變。素娟等人[15]采用Ames試驗、小鼠睪丸染色體畸變試驗和小鼠骨髓細胞微核試驗對鹽藻β-蘿卜素的抗突變作用研究發(fā)現(xiàn)，劑量組與對照組之間的差異均無顯著性。國外對β-蘿卜素的抗突變和抗腫瘤作用表明,β-蘿卜素的抗突變作用與致突變物的作用機制及致突變物的作用方式(如處理方式及處理濃度等)有關。但是，鹽藻β-蘿卜素的抗突變和抗腫瘤的詳細機理還有待進一步探討。β-蘿卜的應用前景（1）β-蘿卜素在食品業(yè)上的應用β-蘿卜素還作為食品添加劑和營養(yǎng)增補劑，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)食品添加劑聯(lián)合專家委員會推薦，被認為是A類優(yōu)秀和有營養(yǎng)的食品添加劑。β-蘿卜素也被用作食物的著色劑。（2）β-蘿卜素在醫(yī)學上的應用β-蘿卜素具有較強的抗氧化作用，能淬滅單線態(tài)氧且是自由基前體單線態(tài)氧的強猝滅劑：1O2+Q→Q*+3O2單線態(tài)氧蘿卜素活化蘿卜素三線態(tài)氧它的抗氧化作用能有效地預防多種疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其是對某些腫瘤和心血管疾病。作為維生素A的前體補充，β-蘿卜素能補充人體維生素A的不足，還能避免維生素A過量的毒副作用和不良反應。（3）β-蘿卜素在飼料上的應用β-蘿卜素、蝦青素等類蘿卜素是天然色素，而且是人和動物體重要的生物活性物質(zhì)，具有增色和營養(yǎng)雙重功效。作為飼料添加劑，能提高動物的生長速率和肉類質(zhì)量，提高牛、馬、豬的繁殖能力，增強蛙魚、蝦的色質(zhì)，加深禽蛋的顏色。（4）β-蘿卜素在日用化妝品上的應用β-蘿卜素在日用化妝品上的應用。研究表明高劑量的β-蘿卜素會減少人們對太陽的敏感度，尤其對那些由于被太陽暴曬而引起皮膚病(例如某些尋麻疹或濕疹)的人特別有幫助。β-蘿卜素的提取物中還含豐富的氨基酸、維生素、天然保濕因子、微量元素和其它生物活性物質(zhì)，很受國際權(quán)威美容專家的好評和消費者的歡迎。在化妝品中添加β-蘿卜素，色澤瑩潤、自然，對皮膚沒有傷害。目前，β-蘿卜素護膚品已上市。1.3利用杜氏鹽藻生產(chǎn)β-蘿卜素1.3.1杜氏鹽藻形態(tài)及分類學特征杜氏藻是單細胞的浮游植物，屬于綠藻門、綠藻綱、團藻目、多毛藻科、杜氏藻屬。其藻體為卵圓形、橢圓形或梨形，長18～28μm，寬9.5～14μm，運動時體形有變化，在不同的鹽度、光照、溫度等環(huán)境下其形態(tài)變化較大。這是因為杜氏藻沒有纖維質(zhì)的細胞壁，外形隨環(huán)境變化而改變，蛋白核及淀粉粒也隨環(huán)境不同而有變化的緣故[16]。杜氏藻細胞前段一般呈凹陷狀，在凹陷處有兩條等長的鞭毛，鞭毛比細胞長約1/3；藻體有一杯狀色素體，色素體的色素主要是葉綠素和類蘿卜素(以β-蘿卜素為主)。在生活條件不良時產(chǎn)生血紅素，藻體呈紅色。在色素體靠近基部有一個較大的蛋白核，細胞上部有一紅色眼點。在不同介質(zhì)和環(huán)境中生長的鹽藻，其色素顏色和細胞含物均有所不同[17]。杜氏藻在生長期間以無性繁殖為主，藻體在運動中縱裂為二，各形成一個新體。杜氏藻不僅分布于全球各種化學類型的鹽水和海水中，在淡水和潮濕土壤中也有存在。通常，白中藻類上浮，使水面呈綠色或紅色，夜間下沉，冬季也常在底層或底泥上。1.3.2杜氏鹽藻的培養(yǎng)以及外界條件對β-蘿卜素積累的影響杜氏鹽藻的培養(yǎng)人們已經(jīng)開發(fā)了多種養(yǎng)殖方式來大量養(yǎng)殖微藻，這些方式包括大型開放池、循環(huán)池、回旋池、級聯(lián)池、大罐、異養(yǎng)發(fā)酵罐及封閉式光合反應器等[18]。與綠藻一樣，杜氏藻在培養(yǎng)液中生長良好，因此很容易將它們培養(yǎng)在含鹽濃度很高的開放池中。由于開放池一般建在氣候炎熱干燥且少云的地區(qū)，并有合適的鹵水來源，遠離污染，因此在該養(yǎng)殖系統(tǒng)中的杜氏藻生長良好，沒有天敵或其他藻類污染[19]，已成為商業(yè)化程度最高、最為普遍的養(yǎng)殖系統(tǒng)[20]。超大型培養(yǎng)池(粗放型模式)，除了風和對流作用外無任何攪拌過程，為保證鹽度、增加對流，通常從海水中泵入低鹽海水至高鹽湖中，同時添加適量營養(yǎng)物質(zhì)，在β-蘿卜素含量達到合適值時，養(yǎng)殖的鹽藻被轉(zhuǎn)移至海岸收獲，處理完畢的培養(yǎng)液重新返回培養(yǎng)池循環(huán)使用[21]；小型葉輪攪拌的回旋池在世界各地被廣泛運用。這種池大多由磚、混凝土、泥土或玻璃纖維建造而成，表面積約為1000～4000m2。CO2氣體不僅是重要的無機碳源，還起到調(diào)控培養(yǎng)液pH值的作用。葉輪攪拌起到均勻熱力、營養(yǎng)及氣體的作用，同時可防止藻體絮凝、減少藻體在高強度和高濃度溶解氧中的光損傷[22]。超級集約型系統(tǒng)是在光合生物反應器基礎上發(fā)展起來的[22]，由于能控制培養(yǎng)參數(shù)，與開放池相比，這樣的系統(tǒng)更清潔、更能獲得高生物量及高含量的類蘿卜素，因此是一種很好的養(yǎng)殖系統(tǒng)。目前商業(yè)化使用的反應器有3種類型平皿光合生物反應器[23]、管狀光合生物反應器[24]和超薄固載結(jié)構(gòu)。兩相(水相/有機相)光合生物反應器也已完成研發(fā)，該反應器的下層為水相，主要是幫助藻細胞生長的培養(yǎng)液，藻細胞持續(xù)產(chǎn)生的類蘿卜素被富集到上層的有機相中；因此該光合生物反應器能提高β-蘿卜素萃取效果。在鼓泡塔光合生物反應器中使用鈣藻酸鹽固定細胞是一種全新的微藻養(yǎng)殖方式，實現(xiàn)了巴氏藻的高密度養(yǎng)殖[39]。盡管封閉系統(tǒng)比開放池系統(tǒng)有明顯的技術優(yōu)勢，如降低污染、減少CO2損耗、靈活的技術設計、穩(wěn)定的養(yǎng)殖條件，但需要建造昂貴的生產(chǎn)設備，而且生產(chǎn)容量也不如開放池系統(tǒng)。環(huán)境因子的影響（1）光照度杜氏藻為光合自養(yǎng)生物，在開放池中，太陽光是唯一光源。在光合反應器中，可選用白色熒光燈或日光燈為其光源。藻的生長及類蘿卜素合成因光質(zhì)和光量的不同有所差異。UV-A射線(320～400nm)可促使杜氏藻大量累積類蘿卜素，不影響其生長[21]。在250w/m2的有效光合輻射(400～700nm)圍，加入8.7w/m2的UV-A可提高約2倍的β-蘿卜素積累量，而且β-蘿卜素的結(jié)構(gòu)更佳，主要為全反式β-蘿卜素[22]。（2）溫度杜氏藻能夠在0℃至45℃圍存活。在室，其最佳生長溫度為32℃，生長允許的溫度圍為25℃～35℃[23]。開放池的溫度通常無法控制，夜晚低溫影響藻體生長，（3）pH值杜氏藻具有很寬的pH耐受圍，0～11圍均能存活，但對于生長而言，最適pH值是9～11。但是當PH值小于5.0或者大于11.0時就會對杜氏鹽藻積累β-蘿卜素起到抑制作用。（4）營養(yǎng)營養(yǎng)缺乏對藻類合成類蘿卜素有促進作用，尤其是氮缺乏時更明顯。晗華、錢凱先認為，杜氏藻生長最適的營養(yǎng)鹽濃度為氮1mmol/L,磷0.3mmo1/L;而細胞個體積累β-蘿卜素的最適條件是無氮、無磷，經(jīng)10d培養(yǎng)，其β-蘿素含量分別達11.24pg/細胞和10.28pg/細胞。杜氏藻缺氮時其β-蘿卜素積累增加。硫酸鹽的缺乏也會使細胞停止生長并刺激β-蘿卜素的積累，但合成速度要比光誘導慢得多。重金屬Cu，Pb達到杜氏鹽藻半致死濃度時，也有促進β-蘿卜素積累的作用。一般來說，在生長速度較低的亞熱帶生長條件下，β-蘿卜素積累量最大。[N]/[P]比是影響杜氏藻生長及甘油和色素積累的另一重要因子。姜建國，汝華(1999)報道，單細胞β-蘿卜素含量隨[N]/[P]比值的增加而減少，而單位體積培養(yǎng)液中的β-蘿卜素含量在[N]/[P]比值小于15時基本不受[N]/[P]比值的影響，比值大于15時，則[N]/[P]比值越高，β-蘿卜素含量越低。1.3.3杜氏鹽藻的應用現(xiàn)狀（1）生產(chǎn)天然類蘿卜素杜氏藻營光合自養(yǎng)，高產(chǎn)品系在特定條件下累積β-蘿卜素的量最高可達細胞干重的10%以上，遠遠高于其他植物，因此第一個被用來商業(yè)化生產(chǎn)β-蘿卜素。澳大利亞、美國和中國等國家已利用杜氏鹽藻大規(guī)模生產(chǎn)天然β-蘿卜素。β-蘿卜素具有很強的抗氧化能力，并且是合成維生素A的前體。除β-蘿卜素外，杜氏鹽藻還含有其他類蘿卜素，如八氫番茄紅素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)等。這些類蘿卜素已廣泛應用于食品、化妝品及醫(yī)藥領域。（2）生產(chǎn)高營養(yǎng)藻粉杜氏鹽藻干粉富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸，以及豐富的類蘿卜素，無難消化的細胞壁，因而是優(yōu)質(zhì)的家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。杜氏鹽藻干粉含40%左右的蛋白質(zhì)，且蛋白質(zhì)的氨基酸組成與大豆相似富含賴氨酸，僅含少量的半胱氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和色氨酸。與其他單細胞來源(如酵母和細菌)的蛋白粉相比，杜氏鹽藻干粉中的核酸(DNA和RNA)含量很低。由于核酸有毒副作用，因此這也是杜氏鹽藻干粉受市場歡迎的一個重要原因。（3）生產(chǎn)甘油和生物制品甘油是一種重要的商業(yè)有機化合物和滲透調(diào)節(jié)物，被廣泛應用于化妝品、醫(yī)藥和食品等領域。目前甘油的主要來源是石油，隨著石油資源的日益減少，開發(fā)新的甘油來源具有重要的戰(zhàn)略意義。杜氏鹽藻富含甘油，在特定養(yǎng)殖條件下，其含量可達干重的50%，因此是甘油生產(chǎn)的潛在資源。除甘油外，杜氏藻還是大規(guī)模生產(chǎn)其他重要生物制品的潛在物種，由于杜氏藻易培養(yǎng)、不易污染、外源蛋白的表達與純化方便，使得生產(chǎn)外源蛋白的成本明顯低于其他系統(tǒng)(如大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞等)，作為一種新型生物反應器，已呈現(xiàn)出巨大的應用前景。（4）提高植物耐鹽性杜氏藻是已知真核生物中最耐鹽的生物，能在35%飽和鹽溶液中生存。其耐鹽機制被認為是通過調(diào)節(jié)自身細胞甘油濃度來實現(xiàn)的。當杜氏藻在高鹽環(huán)境中生長時，細胞的甘油含量將超過50%，以此補償細胞外的滲透壓差，同時為酶提供“合適的溶質(zhì)”以防止酶失活或受到抑制。但杜氏藻的耐鹽機制十分復雜，到目前為止遠未完全清楚，有待進一步研究。杜氏藻耐鹽機制的闡明及耐鹽基因的克隆，將對提高高等植物的耐鹽性、擴大和提高農(nóng)作物的種植圍和產(chǎn)量、緩解世界糧食危機，具有不可估量的意義。（5）廢水處理廢水處理包括3個層次：初級處理、二級處理和三級處理。其中二級處理是利用微生物對各種有機物進行生物降解。在此階段，杜氏藻與其他微生物共生，可促進微生物的生長，同時杜氏藻消耗微生物分解產(chǎn)生的氮、磷和CO2等無機物，提供微生物需要的O2。研究顯示，特氏杜氏藻中的金屬結(jié)合肽和植物螯合肽可將無機砷代謝成砷聚合物，從而達到去除環(huán)境中重金屬的目的。（6）環(huán)境指示相對其他測試生物(如動物)而言，藻類對生活污水或工業(yè)廢水有更高的敏感性。利用藻類來指示環(huán)境毒性的研究，最近有很多報道。SantinMontanya等報道了七種微藻對海洋環(huán)境殺蟲劑的測試方法，指出普氏杜氏藻是禾草滅、稀禾定、苯嗪草酮、二氯吡啶酸等殺蟲劑的最佳指示劑。黃小娟等[24]利用杜氏藻生長阻礙實驗，測定排放到環(huán)境中特別是飲用水中的有機毒物，從而得知被測化合物的生物毒性。這種行之有效的測試飲用水污染的方法，在水質(zhì)污染監(jiān)測和控制方面有著廣闊的應用前景1.4外源激素水酸與杜氏鹽藻的β-蘿卜積累1.4.1水酸的性質(zhì)1976英國的Edmundstone首先發(fā)現(xiàn)柳枝皮可以治療瘧疾和鎮(zhèn)痛解熱，1828年德國JohnBuchner從柳樹皮中分離出少量的水苷（Salicin）1838年Piria將柳樹皮中這種活躍的有效成分命名為水酸(SalicylicAcid，簡稱SA)；1874年首次合成水酸，水酸的化學名稱為鄰羥基苯甲酸。水酸是一種植物體產(chǎn)生的簡單酚類化合物，廣泛存在于高等植物中。純品是一種帶狀態(tài)結(jié)晶或輕質(zhì)的結(jié)晶性粉末，化學式為C6H4(OH)(COOH)，分子量是138.121，比重1.443。水酸易溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯、丙酮、松節(jié)油，不易溶于水，20℃時溶解度為每100毫升0.2克水酸是肉桂酸的衍生物，在植物體合成，一般認為是通過莽草酸先形成肉桂酸，然后經(jīng)過兩條途徑生成水酸：一種是肉桂酸先經(jīng)過β-氧化產(chǎn)生苯甲酸，在經(jīng)過羥化即產(chǎn)生水酸；另一種是肉桂酸先經(jīng)過羥基化產(chǎn)生鄰香豆酸，再經(jīng)β-氧化產(chǎn)生水酸。1.4.2水酸的生理作用（1）抗病作用水酸在植物抗病性中的作用是目前研究最深入的，水酸在植物的抗病反應中主要起信號分子的作用，是植物產(chǎn)生過敏反應(HR)和系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)所必需的物質(zhì)。1979年White首先發(fā)現(xiàn)外源水酸及其衍生物乙酰水酸處理煙草可誘導病程相關蛋白的合成和對煙草花葉病毒的抗性。以后的研究進一步表明，外源SA可誘導番茄、黃瓜、水稻、大蒜、大豆、甜菜、擬南芥等植物對真菌、細菌、病毒等病原菌的抗性。水酸誘抗作用的發(fā)現(xiàn)為今后研制新型誘抗劑，減少有害農(nóng)藥的使用提供了新的思路和途徑，因而倍受人們的關注。（2）誘導開花1965年Lee和Skoog發(fā)現(xiàn)SA可誘導煙草組培植株開花，1974年Cleland和Ajami鑒定誘導短日植物開花的物質(zhì)是水酸；外施水酸于浮萍科植物可誘導或促進開花。水酸與蔗糖混合施用可促進文心蘭開花，水酸、赤霉素和β-萘酚誘導短日植物鳳仙花在長日照下形成花芽?，F(xiàn)在對水酸誘導植物開花的機理仍不十分清楚,有一種假說認為是水酸起螫合劑作用[25]。（3）提高植物抗環(huán)境脅迫能力近年來的研究表明，水酸在植物抗冷、熱、干旱、鹽、臭氧、重金屬等環(huán)境脅迫方面有明顯的作用。在馬鈴薯等產(chǎn)熱植物上，水酸可促進線粒體交替呼吸途徑，增加產(chǎn)熱量，提高馬鈴薯的抗冷性。Yalpani等發(fā)現(xiàn)煙草受到熱脅迫時其源SA水平升高。高溫脅迫使黃瓜葉片游離態(tài)水酸增加2.5倍以上。在1.2%的NaCl脅迫下，外施0.1g/LSA和0.2g/LASA可以提高小麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，提高幼苗體SOD、CAT等細胞保護酶的活性，抑制了MDA的積累，提高了小麥幼苗葉片對鹽脅迫的適應性。有人提出，在鹽脅迫條件下，外源SA能夠顯著提高Na+向下運輸?shù)倪x擇性而增強K+向上運輸?shù)倪x擇性,因此,能顯著提高植物體的抗鹽性。此外,SA還與臭氧、重金屬脅迫等有關。（4）生熱效應天南星科植物佛焰花序的生熱現(xiàn)象很早就被認識到了，直到1987年Raskin等試驗證明，引起生熱的物質(zhì)就是水酸。正如Voodoo百合雄花的提取液一樣，外源施用SA也可以使成熟花上部佛焰花序的溫度提高。SA能夠產(chǎn)熱的原因被認為是由于其可增加植物抗氰呼吸，抗氰呼吸電子傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生的能量多以熱的形式釋放出來，而不主要合成化學能；用抗氰呼吸抑制劑處理，放熱就減少；SA對非產(chǎn)熱植物的抗氰呼吸也有誘導作用。1.4.3水酸的應用1763年英國的EdmundStone首先發(fā)現(xiàn)柳樹皮有很強的收斂作用，可以治療瘧疾和發(fā)燒，后來研究證明水酸在植物界普遍存在，作為一種植物源信號分子，對植物的許多生理過程如植物開花、產(chǎn)熱、種子發(fā)芽、氣孔關閉、膜通透性及離子的吸收等起調(diào)控作用，一些科學家認為應該將之作為一種新的植物激素來看待。有關水酸與植物抗逆的研究始于20世紀70年代，研究發(fā)現(xiàn)：SA與植物抗病之間存在著莫大的關聯(lián)，SA應用于植物抗生物脅迫的研究逐漸成為植物抗逆性研究的熱點。近十多年來，關于SA對植物抗病性的誘導及其作用機制、SA信號轉(zhuǎn)導途徑等方面的研究也已取得重大進展。此外，SA用于植物抵抗非生物脅迫(重金屬、臭氧、紫外輻射、高溫、低溫、干旱、鹽漬等逆境)的研究也開始受到廣泛關注?，F(xiàn)已證明：水酸不僅可以調(diào)節(jié)植物的某些生長發(fā)育過程，還能誘導植物產(chǎn)生抗逆性，抵抗不良因素造成的傷害。1.4.4水酸與β-蘿卜素近年來，國外對杜氏鹽藻的培養(yǎng)條件和β-蘿卜素的誘導條件進行了大量的研究，研究發(fā)現(xiàn)鹽藻的最適生長條件和β-蘿卜素最適積累條件存在很大的差異，一般在高鹽度、強光、營養(yǎng)饑餓等條件下，鹽藻能夠大量積累β-蘿卜素，但此條件下不適于鹽藻的生長；而在最適的生長條件下，β-蘿卜素又無法大量的積累。為了解決這一矛盾，周世水等進行了二步法培養(yǎng)的研究，即在鹽藻的生長階段和β-蘿卜素的積累階段采用不同的培養(yǎng)方法，以獲得最大的β-蘿卜素產(chǎn)量。目前，對利用鹽藻生產(chǎn)β-蘿卜素的研究主要集中于外界條件這一層次上，如鹽度、光照強度、溫度、營養(yǎng)液等。而外源激素水酸對鹽藻β-蘿卜素積累研究很少。水酸作為一種植物激素，主要的研究集中于高等植物。本文初步研究了不同濃度的水酸對鹽藻生長和物質(zhì)積累的影響。實驗結(jié)果表明在一定圍，低濃度（1mg/L）的水酸對鹽藻的生長具有一定的促進作用；高濃度（5mg/L、10mg/L）的水酸前期對細胞的生長具有一定的促進作用，后期具有明顯的致死作用。在一定圍。較低濃度的水酸對色素的積累具有一定的促進作用，本實驗中1mg/L的水酸促進作用最明顯，可以明顯加快色素的積累進程。在色素積累過程中，鹽藻總可溶性蛋白含量的變化規(guī)律與藻細胞生長趨勢基本保持一致。第二章材料與方法2.1杜氏鹽藻的培養(yǎng)2.1.1藻種杜氏鹽藻原藻種購自中國海洋大學2.1.2藻種培養(yǎng)在5L三角瓶裝3L液體培養(yǎng)基，接種一定體積的原藻液，且接種細胞為分裂能力較強的綠色游動細胞。由日光燈提供照明，12h/12h光暗周期照明，光強為1000Lx，恒溫下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20℃本實驗采用MCM培養(yǎng)基，其中各營養(yǎng)成分濃度如下：（一）大量元素：KNO30.2g/LKH2PO427mg/LNAHCO31.5g/LNaCL150g/L（二）微量元素H3BO30.61mg/LZnCL24.1μg/LCuSO4·5H2O60μg/LCoCL·6H2O51μg/LMnCL2·4H2O41μg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O0.38mg/L（三）螯合鐵溶液Na2·EDTA1.89mg/LFeCL3·6H2O2.44mg/L2.2實驗材料2.2.1藥品與試劑水酸、牛血清白蛋白、蒸餾水、95%乙醇、丙酮、飽和食鹽水、85%濃磷酸0.05MPH7.8PBS：25mL0.2MKH2PO4+22.6mL0.2MNaOH加水稀釋定容至100mL考馬斯亮藍G-250：稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL90%乙醇中，加入85%濃磷酸100mL，最后用蒸餾水定容至1000mL。常溫下可保存一月2.2.2儀器冰箱、血球計數(shù)板、1.5mLEP管、三角瓶（250mL、4L）、比色皿、量筒、容量瓶、膠頭滴管、蓋玻片、細線、封口膜、pH試紙、玻璃棒、藥匙、移液槍等電子天平（HANGPINGFA1004）可見分光光度計（上海光譜儀器723型）超聲波破碎儀（新芝生物科技股份CV33）超速離心機（TGL—16G）臺式高速冷凍離心機（HERMLEZ323K）臺式低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠LG10—2.4A）高壓蒸汽滅菌鍋超凈工作臺（DL—CJ—IN）普通光學顯微鏡（SEC—282）2.3實驗方法2.3.1水酸的配置水酸不易溶于水，但易溶于有機溶劑，本實驗利用少量無水乙醇溶解水酸粉末后，再添加無菌水水配制成水酸母液。通過向藻液中加入不同體積的水酸母液來達到不同的濃度，具體步驟如下：用電子天平準確稱量0.1g水酸粉末于小燒杯中，加入少量95%乙醇充分溶解，然后轉(zhuǎn)移入100mL容量瓶中，用適量蒸餾水反復沖洗小燒杯并轉(zhuǎn)入容量瓶中，定容至100mL，從而配制成1g/L的母液。2.3.2鹽藻的誘導本實驗設置了空白、1mg/L、5mg/L、10mg/L四個水酸濃度梯度[31]，每個濃度設置三個重復。將250mL培養(yǎng)瓶中的藻液培養(yǎng)到生長對數(shù)期，依次標號各濃度值。在超凈工作臺上移入不同體積的水酸酸母液，以實現(xiàn)不同濃度的SA對鹽藻的誘導，0、1、5、10mg/L水酸濃度分別加入0、0.1、0.5、1mL的母液。2.3.3實驗培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為20℃，光強約為3500L2.3.4鹽藻細胞生長的測定鹽藻細胞密度的測定采用血球計數(shù)板法，計數(shù)時，先用酒精將鹽藻細胞殺死，防止鹽藻細胞活動能力太強影響計數(shù)的準確性。具體的操作方法參照微生物學實驗指導，每個三角瓶測量一次，每個濃度的三個重復求平均值。每三天測量一次。利用下面的公式計算出藻液密度，并記錄實驗數(shù)據(jù)。設五個方格中總菌數(shù)為A，菌液的稀釋倍數(shù)為B，計數(shù)板的方格為25個則：1mL菌液中總菌數(shù)=A/5×25×10000×B=50000AB(個)2.3.5鹽藻細胞的收集取10mL離心管18個，分別標注好重復組數(shù)、激素名稱、濃度、需測量的指標（可溶性蛋白或色素）及取樣日期；在超凈工作臺中用1mL的移液槍分別從每個培養(yǎng)瓶中取3mL（色素）或1.5mL（可溶性蛋白，可溶性蛋白的測量只取對照組和5mg/L兩組）藻液轉(zhuǎn)移至對應的離心管中，配平后，在低溫高速離心機中，于6000rpm下離心10min，棄去上清，應盡量棄除上清；將收集好的藻泥于-20℃的冰箱中保存，以備后期色素含量和可溶性蛋白含量的測定；每三天取樣一次2.3.6鹽藻色素含量的測定（1）處理藻細胞樣品從冰箱中取出用于待測色素含量的樣品，于室溫下融化，分別向每個離心管中注入3mL90%的丙酮。（2）超聲波破壁在功率40W，周期1min，破壁15s，間隔5s，3個循環(huán)的條件下進行破壁。破壁過程中需要冰浴保護，防止超聲波破壁儀工作中產(chǎn)生的高溫對藻細胞的灼傷。（3）離心：將破壁完的藻液分裝于兩個EP管中，配平后，于低溫高速離心機中，10000rmp條件下離心10min。（4）比色：離心完畢后，取上清液，以90%的丙酮為對照，在450nm處測色素的OD值，并記錄實驗數(shù)據(jù)。（5）計算：根據(jù)Jensen公式可以換算出藻液中β-蘿卜素含量，β-蘿卜素含(mg/L)=A450×提取液的體積(mL)×稀釋倍數(shù)×103／25002.3.7鹽藻總可溶性蛋白含量的測定(1)標準曲線的制作準確稱量牛血清白蛋白（BSA）10mg，溶于蒸餾水并定容至100mL，配成100μg/mL的BSA原液。取6支試管，按照表2數(shù)據(jù)配置0~100μg/mL牛血清白蛋白溶液各1mL。后加入4mL考馬斯亮藍G-250試劑，使其充分混合，放置2min后，在595nm下比色測定各管的吸光度值，以蛋白質(zhì)量為Y軸，吸光度值為X軸繪制標準曲線。表2牛血清白蛋白(BSA)標準曲線加樣過程試管號123456BSA原液（mL）00.81.0蒸餾水（mL）1.00.20BSA濃度（μg/mL）020406080100(2)鹽藻總可溶性蛋白含量的測定(1）處理藻細胞樣品：從冰箱中取出用于待測可溶性蛋白含量的樣品，于室溫下融化，分別向每個離心管中注入3mLPBS。（2）超聲波破壁：在功率40W，周期1min，破壁15s，間隔5s，3個循環(huán)的條件下進行破壁。破壁過程中需要冰浴保護，防止超聲波破壁儀工作中產(chǎn)生的高溫對藻細胞的灼傷。（3）離心：，配平后，于低溫高速離心機中，6000rmp條件下離心10min。（4）比色：取上清液1mL，加入4mL考馬斯亮藍G-250，充分混勻，靜置2min，以1mLPBS和4mL考考馬斯亮藍G-250的混合物為對照，在595nm測量相應的吸光度值，并記錄實驗數(shù)據(jù)。（5）計算：根據(jù)以下公式計算總可溶性蛋白的含量總可溶性蛋白的含量（μg/mL）=(m×VT)/(Vs×V)式中m：查標準曲線所得1mL上清中蛋白質(zhì)的含量（μg）VT：提取液總體積（mL）Vs：測定所提取液體積（mL）V：取樣量（mL）第三章結(jié)果與討論3.1鹽藻細胞生長曲線3.1.1細胞形態(tài)的觀察實驗前藻液經(jīng)擴增綠藻細胞生物量較大，顏色呈綠色，當加入水酸，并進行復合脅迫，隨培養(yǎng)時間增加（1-6天），藻液顏色逐漸變深，同時出現(xiàn)藻細胞聚集現(xiàn)象，細胞活動能力下降；6天以后藻液顏色逐漸變?yōu)辄S綠色（圖2），隨培養(yǎng)時間增加，1mg/L處理組黃色逐漸加深，對照組顏色也逐漸變淺，但是沒有1mg/L的處理組變化明顯；5mg/L和10mg/L處理組逐漸出現(xiàn)白化現(xiàn)象（圖3、4），說明藻細胞開始逐漸死亡。通過鏡檢發(fā)現(xiàn)藻細胞經(jīng)過18天誘導藻細胞的顏色由綠色變?yōu)辄S綠色（圖5、6）。圖218d時1mg/L的藻液直觀圖圖318d時5mg/L的藻液直觀圖圖418d時10mg/L的藻液直觀圖圖5誘導前的鹽藻細胞圖6誘導后的鹽藻細胞（18d）3.1.2鹽藻細胞生長的測定圖7鹽藻的生長趨勢3.1.3鹽藻細胞生長的討論由圖7可見，對照組和各處理組在誘導培養(yǎng)1～6天時，藻細胞的密度都是快速上升的。從培養(yǎng)6天往后就發(fā)生了變化，對照組和1mg/L的水酸處理組在誘導培養(yǎng)6～15天過程中藻細胞密度都是上升的，15天時達到高峰，而后又逐步下降，1mg/L處理組的上升趨勢明顯高于處理組，說明在一定圍，低濃度的水酸對鹽藻的生長有促進作用。5和10mg/L處理組在誘導培養(yǎng)6～15天過程中藻細胞呈下降趨勢，10mg/L的處理組下降幅度要大于5mg/L的處理組。高濃度的水酸在誘導前期對鹽藻細胞的生長有促進作用，在誘導后期有明顯的致死作用。這與本人導師孟春曉[32]等關于赤霉素對鹽藻生物量和物質(zhì)積累的影響中的研究相符合。其研究表明低濃度的赤霉素對鹽藻的生長具有一定的促進作用，較高濃度的赤霉素對鹽藻生長的影響是先促進細胞分裂后抑制鹽藻生長，變化趨勢是先升后降。TestsofBetween-SubjectsEffectsDependentVariable:細胞個數(shù)SourceTypeIIISumofSquaresdfMeanSquareFSig.CorrectedModel1.007E12101.007E113.633.006Intercept5.700E1215.700E12205.610.000天數(shù)2.590E1173.700E101.335.283激素濃度7.481E1132.494E118.995.000Error5.822E11212.772E10Total7.290E1232CorrectedTotal1.589E1231a.RSquared=.634(AdjustedRSquared=.459)經(jīng)F檢驗結(jié)果表明，不同SA濃度之間的F值大于F0.01=4.87，故不同的SA濃度對細胞生長有極顯著影響。3.2鹽藻色素含量3.2.1色素含量的測定圖8鹽藻色素含量變化趨勢3.2.2色素含量的討論由圖8可以看出，對照組和處理組的色素（主要是β-蘿卜素）含量都是先升后降的，5和10mg/L處理組在第6天達到最大值，這是由于水酸對鹽藻細胞生長具有一定的促進作用，使鹽藻細胞大量分裂，數(shù)目上升。從而導致色素含量的上升。6天以后，由于鹽藻細胞大量死亡，從而導致色素的含量急劇下降；對照組和1mg/L處理組的色素在誘導前18天都是逐漸上升的，18天到達最大值。18天以后，色素的含量逐步下降。在一定的圍，低濃度的水酸對鹽藻細胞生長具有一定的促進作用，即鹽藻細胞的生物量比較多，同時低濃度的水酸還能促進細胞產(chǎn)生色素，所以色素總量比較大。18天以后，由于生存條件的限制，藻細胞逐漸開始死亡，色素的含量也有所降低。有研究表明，某些高等植物激素能夠顯著促進雨生紅球藻中蝦青素的積累[26-31]，如5mg/L的水酸能有效促進雨生紅球藻積累蝦青素（營養(yǎng)鹽饑餓，25℃，5000lx，24h連續(xù)光照培養(yǎng)），第21天時，蝦青素的含量達到最高，與對照相比增幅達到75.8%。蝦青素素是類蘿卜的一種。而通過比較已獲得的鹽藻cbr基因和雨生紅球藻的β-蘿卜素酮化酶基因5'上游側(cè)翼序列后發(fā)現(xiàn)，二者具有較高的相似性，主要體現(xiàn)在都含有幾個相似的高等植物激素功能元件[33]。根據(jù)上述推測，外源植物激素或生長調(diào)節(jié)劑也可以促進鹽藻積累天然βTestsofBetween-SubjectsEffectsDependentVariable:色素濃度SourceTypeIIISumofSquaresdfMeanSquareFSig.CorrectedModel.09811.0092.635.Intercept.5461.546160.772.000激素濃度.0823.0278.018.001天數(shù).0178.002.616.756Error.08224.003Total.72636CorrectedTotal.18035a.RSquared=.547(AdjustedRSquared=.339)F檢驗結(jié)果表明，不同SA濃度之間的F值大于F0.01=4.72，故不同的SA濃度對色素積累有極顯著影響。3.3蛋白標準曲線的制作表30~100μg/mL牛血清白蛋白溶液所對應的OD值A59500.1520.2520.3620.4850.6蛋白質(zhì)含量（μg/mL）020406080100圖9牛血清白蛋白標準曲線3.4鹽藻總可溶性蛋白3.4.1總可溶性蛋白含量的測定圖10鹽藻總可溶性蛋白含量變化趨勢3.4.2總可溶性蛋白含量的討論由圖10可知，5mg/L處理組在第3-6天時期可溶性蛋白的含量有一個上升的過程，而后呈下降趨勢。這是由于前期水酸促進細胞分裂，藻細胞數(shù)目增多，可溶性蛋白含量隨之上升，后期由于生存條件的限制，藻細胞大量死亡導致可溶性蛋白含量亦隨之下降。對照組的可溶性蛋白含量在18天之前呈上升趨勢，18天達到最大值，而后逐步下降，這是由于營養(yǎng)鹽饑餓等一系列生存條件限制?？扇苄缘鞍缀康淖兓厔萃毎芏鹊淖兓厔莼疽恢隆＿@與曾正兵[34]等關于NAA對鹽藻生長與物質(zhì)積累的影響的研究相符合，其研究表明隨著萘乙酸濃度的遞增，總可溶性蛋白的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。TestsofBetween-SubjectsEffectsDependentVariable:蛋白含量SourceTypeIIISumofSquaresdfMeanSquareFSig.CorrectedModel292.439836.555.971.522Intercept16359.229116359.229434.558.000天數(shù)171.113724.445.649.709濃度121.3261121.3263.223.116Error263.520737.646Total16915.18716CorrectedTotal555.95915a.RSquared=.526(AdjustedRSquared=-.016)F檢驗結(jié)果表明，不同SA濃度之間的F值小于F0.01=12.25，故不同的SA濃度對可溶性蛋白量不存在顯著影響。第四章結(jié)論1.在一定濃度圍，低濃度（1mg/L）的水酸對鹽藻的生長具有一定的促進作用；高濃度（5mg/L、10mg/L）的水酸前期對細胞的生長具有一定的促進作用，后期具有明顯的致死作用。2.在一定濃度圍。較低濃度的水酸對鹽藻色素（主要是β-蘿卜素）的積累具有一定的促進作用，本實驗中1mg/L的水酸促進作用最明顯，可以明顯加快色素的積累進程。3.在色素積累過程中，鹽藻總可溶性蛋白含量的變化規(guī)律與藻細胞生長趨勢基本一致。參考文獻[1]峰，姜悅.微藻生物技術[M].北京：中國輕工業(yè)，1999,14-16.[2]朱秀靈，車振明，等.β－蘿卜素的生理功能及其提取技術的研究進展[J].食品工業(yè)科技，2004(20):158-162[3]蔡明剛，王杉霖.利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的研究進展[J].海峽2003，2（4）:537-542[4]顏秀花，王正武，王仲妮.β-蘿卜素的應用及研究進展[J].食品與藥品，2007（6）：58-61[5]曾強松，童海寶，徐靜安.三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)β-蘿卜素的工藝研究[J].工業(yè)微生物，2002，32（4）：7-10[6]廖春麗，余曉斌，海麗.響應面法優(yōu)化β-蘿卜素液體發(fā)酵培養(yǎng)基[J].食品與生物技術學報，2007，26（3）：95-99[7]臣，阮榕生.紅酵母的性質(zhì)及其應用研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2006（5）：20-23[8]萌萌，王衛(wèi)衛(wèi)，侯小娟.螺旋藻突變株MS-3β-蘿卜素提取的研究[J].交通大學學報，2006，25（4）：131-133[9]江志琴，朱心強.高劑量β-蘿卜素對大量吸煙者肺癌的不利影響[J].國外醫(yī)學:衛(wèi)生學分冊，2005，32(5):265–269[10]蕾，蔭士安.影響蔬菜中β-蘿卜素轉(zhuǎn)化為維生素A的因素[J].國外醫(yī)學:衛(wèi)生學分冊，2005，32(1):27-30[11]ChidambaraMurthyK.N，VanithaA.，RajeshaJetal.InvivoantioxidantactivityofcarotenoidsfromDunaliellasalina—agreenmicroalga[J].LifeSciences,2005:76(12):1381-1390[12]王春波，藍孝貞，魯平，等.鹽藻β-蘿卜素對實驗性動脈粥樣硬化預防作用的研究[J].中國海洋藥物，1998，(1):7-12[13]雪紅，先榮，柱海，等.鹽藻β-蘿卜素促進學習和記憶的作用[J].中國海洋藥物雜志，2006，25(2):48-52[14]馬建國，薛開先，吳建中，等.鹽藻β-蘿卜素抗突變效應[J].中國藥理學報，1998，19(3):282-284[15]素娟，王淑惠，鄧雪，等.鹽藻素抗突變作用的初探[J].衛(wèi)生毒理學雜志，2003，17(1):65-66[16]福，馬若欣，呂愛玲，等.極端嗜鹽綠色杜氏藻生物學特性研究(一)[J].海湖鹽與化工，2005，34(1)∶26–27[17]林廣鳳.鹽生杜氏藻的生物學特性及其開發(fā)應用[J].齊魯漁業(yè)，2006，23(11):7-10[18]PULZO.Photobioreactors:productionsystemsforphototrophicmicroorganisms[J],Appl.Microbiol.Biotechnol.2001,57(3):287-293.[19]BOROWITZKALJ,BOROWITZKAMA.Commercialproductionofβ-carotenebyDunalellasalinainopenponds[J].BullMar.Sci,1990,47(3):244-252.[20]BOROWITZKAMA.Com