第五單元驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

第五單元驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)第一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)一外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離（不連續(xù)密度梯度法）

（驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)）第二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的細(xì)胞群。在研究免疫細(xì)胞時(shí)，常常需要先將淋巴細(xì)胞等分離純化，再進(jìn)一步進(jìn)行檢測(cè)。第三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日根據(jù)各種血細(xì)胞的體積、形態(tài)、密度和比重均有差異，可將不同的細(xì)胞分離。實(shí)驗(yàn)原理不同類別人類血細(xì)胞的密度如下：多形核白細(xì)胞比重1.092血小板比重約為1.032單個(gè)核細(xì)胞比重為1.076～1.090紅細(xì)胞比重為1.093第四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日利用一種比重介于1.075～1.092之間等滲的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）混合液（淋巴細(xì)胞分離液），比重為1.077±0.001，進(jìn)行密度梯度離心。離心后不同比重的血細(xì)胞在分離液中呈梯度分布。實(shí)驗(yàn)原理紅細(xì)胞和多形核粒細(xì)胞密度大于分離液，沉于管底；血小板因密度小而懸浮于血漿中；單個(gè)核細(xì)胞的密度略小于分離液，懸浮于分離液上層與血漿層交界處，呈云霧狀白膜層。第五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日血漿

單個(gè)核細(xì)胞分離液粒細(xì)胞紅細(xì)胞第六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日器材:試管、滴管、吸管、無菌干燥注射器、無菌棉球、橡皮止血帶、水平式離心機(jī)、生物顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。試劑:1．淋巴細(xì)胞分離液（比重1.0770.001）。2．肝素溶液用生理鹽水配制成500U/ml。3．Hanks液。4．2g/L臺(tái)盼藍(lán)染液。5．標(biāo)本肝素抗凝的人外周靜脈血。6.白細(xì)胞稀釋液。實(shí)驗(yàn)材料第七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

抗凝全血緩沖液1．室溫下，將2ml抗凝血與2mlHanks液混合實(shí)驗(yàn)方法第八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日2．取分離液2ml置入滅菌離心管內(nèi)，用毛細(xì)吸管將稀釋血液4ml沿管壁加入離心管，使稀釋血液重疊于淋巴細(xì)胞分離液上（分離液與稀釋血液體積比例為1：2）。分離液3．配平后將離心管置于水平式離心機(jī)內(nèi)，以2000r/min離心20min。實(shí)驗(yàn)方法第九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日4．離心后管內(nèi)容物從上至下分為四層：上層為血漿層中層為細(xì)胞分離液下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞上、中層界面處呈現(xiàn)白色渾濁即為單個(gè)核細(xì)胞層。實(shí)驗(yàn)方法血漿單個(gè)核細(xì)胞分離液紅細(xì)胞和粒細(xì)胞第十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日5.用吸管插到血漿與分離液的界面處，沿管壁周緣吸出單個(gè)核細(xì)胞。6.置入另一離心管中，加入５倍體積的Hanks液混勻，1500rpm離心10min。7.棄上清，將沉淀細(xì)胞振搖重懸后加Hanks液。8.按上述方法洗滌2次。

9.末次離心后，吸盡上清，再加入Hanks液將細(xì)胞懸液體積還原至1ml。10.吸取20l細(xì)胞懸液加380l白細(xì)胞稀釋液混勻2～3min。11.吸取15l滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，充池計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)方法第十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日4個(gè)藍(lán)色區(qū)域?yàn)榘准?xì)胞計(jì)數(shù)池第十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日活細(xì)胞可排斥染料不被著色，折光性強(qiáng)死細(xì)胞著藍(lán)色，體積略膨大。正常情況下，活細(xì)胞比例大于95%。結(jié)果判斷第十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1．分離不同種類動(dòng)物外周血單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，對(duì)分離液的密度要求不同。人的細(xì)胞密度為1.0770.001。大鼠為1.0880.001。小鼠為1.0920.001。兔為1.0960.001等。2．將血液稀釋后分離可降低血液粘稠度和紅細(xì)胞聚集，提高單個(gè)核細(xì)胞的回收率。注意事項(xiàng)第十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日3．向分離液管加稀釋血液時(shí)，應(yīng)沿管壁緩緩加入，使血液與分離液形成明顯界面。注意輕拿輕放，避免沖散界面。4．為保持淋巴細(xì)胞活性，采血后應(yīng)在2h內(nèi)分離細(xì)胞，盡快完成操作全程。5．離心時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速的增加或減少要注重均勻、平穩(wěn)，以免影響分離效果。第十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.本法制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液能滿足許多細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)的要求，若需要進(jìn)一步進(jìn)行T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞的純化，可考慮采用哪些方法？2.如何檢測(cè)細(xì)胞得率與淋巴細(xì)胞純度？實(shí)驗(yàn)討論福建醫(yī)科大學(xué)陳敏第十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)二T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)）第十七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日T淋巴細(xì)胞增殖分化、DNA等大分子物質(zhì)合成增加淋巴母細(xì)胞刺激物PHA體積變大胞漿增多、空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松基本原理有絲分裂同位素法

MTT法形態(tài)法第十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.實(shí)驗(yàn)原理3.試劑與器材4.操作步驟5.結(jié)果判斷6.注意事項(xiàng)7.實(shí)驗(yàn)討論教學(xué)內(nèi)容第十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

一、形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法

第二十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的原理。2.熟悉淋巴母細(xì)胞的形態(tài)特征及判定方法。第二十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

T淋巴細(xì)胞在有絲分裂原PHA等刺激后，細(xì)胞的形態(tài)和代謝發(fā)生變化，發(fā)生一系列增殖反應(yīng)，如出現(xiàn)細(xì)胞體積增大、核染色質(zhì)疏松、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，并轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)原理第二十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.RPMIl640培養(yǎng)液。小牛血清10%、青霉素100u/m1、鏈霉素100ug/m1，用無菌3%NaHCO3調(diào)pH至7.2～7.4。2.植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清的RPMI培養(yǎng)液稀釋至500～1000g/ml。3.姬姆薩染液。4.標(biāo)本

肝素抗凝人外周靜脈血。5.器材

細(xì)胞培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、高壓滅菌器、無菌過濾裝置、離心機(jī)、顯微鏡等。試劑與器材

第二十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日5%CO2

37℃72h1500rpm離心10min染色鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)PHA無PHA外周血0.2ml吸取白細(xì)胞層涂片操作步驟第二十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1．取肝素抗凝血0.2ml，注入預(yù)先加有1.8mlRPMI1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，同時(shí)加入PHA(500g/ml)0.1ml，對(duì)照瓶?jī)?nèi)不加PHA?；靹蚝笾?7C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72h，期間每天旋轉(zhuǎn)搖勻一次。2．培養(yǎng)結(jié)束后，棄去上清，混勻細(xì)胞，加入離心管中，1500rpm離心10min。操作步驟第二十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

3．棄上清，吸取白細(xì)胞層制片，自然干燥。

4．甲醇固定1～2min后，姬姆薩染色15～20min，水洗，干燥。

5．油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，觀察淋巴細(xì)胞的形態(tài)變化，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。第二十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日淋巴細(xì)胞標(biāo)志及功能檢測(cè)龔道科2002.4未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞結(jié)果判斷第二十七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12~2012~166~8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1~4個(gè)有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第二十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日結(jié)果判斷第二十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

1.分離不同種類動(dòng)物外周血單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，對(duì)分離液的密度要求不同。如分離人的細(xì)胞密度為1.0770.001。大鼠為1.0880.001。小鼠為1.0920.001。兔為1.0960.001等。

2.將血液稀釋后分離可降低血液粘稠度和紅細(xì)胞聚集，提高單個(gè)核細(xì)胞的回收率。注意事項(xiàng)第三十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日3.向分離液管加稀釋血液時(shí)，應(yīng)沿管壁緩緩加入，使血液與分離液形成明顯的界面。注意輕拿輕放，避免沖散界面。4.為保持淋巴細(xì)胞活性，采血后應(yīng)在2h內(nèi)分離細(xì)胞，盡快完成操作全程。5.離心時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速的增加或減少要注重均勻、平穩(wěn)，以免影響分離效果。第三十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.本法制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液能滿足許多細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)的要求，若需要進(jìn)一步進(jìn)行T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞的純化，可考慮采用哪些方法？2.如何檢測(cè)細(xì)胞得率與淋巴細(xì)胞純度？實(shí)驗(yàn)討論第三十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

二、MTT比色法第三十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏煜TT比色法進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的原理及其操作方法。第三十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

T淋巴細(xì)胞受到PHA作用后發(fā)生活化增殖，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，四甲基噻唑藍(lán)（MTT）作為其底物參與反應(yīng)，被催化形成藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢(fomazan)，經(jīng)鹽酸─異丙醇或溶解后為藍(lán)色溶液。甲臢的形成量與細(xì)胞增殖活化的程度呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)原理：第三十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.RPMIl640培養(yǎng)液。2.植物血凝素（PHA）。3.標(biāo)本

肝素抗凝人外周靜脈血。4.器材

超凈工作臺(tái)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、無菌過濾裝置、振蕩器、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀等。試劑與器材第三十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日5%CO2

37℃68h1500rpm離心10min酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀A570nm鹽酸異丙醇100l/孔操作步驟分離外周血單個(gè)核細(xì)胞1106/ml

培養(yǎng)板（含PHA）培養(yǎng)板（無PHA）加入MTT20l/孔

4h100l/孔

第三十七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.先采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，并用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1106/ml。2.將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，100l/孔，每個(gè)樣品三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)相應(yīng)對(duì)照孔。實(shí)驗(yàn)孔加含50g/ml的PHA(終濃度5g/ml)100l，對(duì)照孔加不含PHA的1640培養(yǎng)液100l。3.混勻后置37C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)68h。操作步驟第三十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日4．將培養(yǎng)板1500rpm離心10min，吸棄上清液，每孔加MTT20l，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加100l鹽酸異丙醇，低速振蕩10min。5．充分溶解后，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀雙波長(zhǎng)570nm/630nm測(cè)定各孔A值，測(cè)定值為A570nm減去630nm的最終結(jié)果。第三十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日結(jié)果判斷以刺激指數(shù)(SI)判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度：第四十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.實(shí)驗(yàn)過程注意無菌操作，避免細(xì)菌污染。2.淋巴細(xì)胞要新鮮制備,一般在采血后2h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。操作時(shí)動(dòng)作要輕柔、迅速，以免損傷細(xì)胞。3.加入鹽酸異丙醇后要在30min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，若規(guī)定時(shí)間內(nèi)來不及測(cè)定，可將未加鹽酸異丙醇的培養(yǎng)板置4C保存。測(cè)定前取出，室溫靜置10min后再加鹽酸異丙醇。注意事項(xiàng)第四十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.試討論MTT比色法檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的優(yōu)缺點(diǎn)？2.MTT比色法容易因細(xì)菌污染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)采取哪些措施可減少實(shí)驗(yàn)誤差，使結(jié)果可信？實(shí)驗(yàn)討論福建醫(yī)科大學(xué)陳敏第四十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)三細(xì)胞吞噬率與

吞噬指數(shù)測(cè)定（驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)）第四十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日分類：大吞噬細(xì)胞—單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)小吞噬細(xì)胞—中性粒細(xì)胞

細(xì)胞吞噬率與吞噬指數(shù)測(cè)定主要檢測(cè)機(jī)體吞噬細(xì)胞的功能。第四十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理試劑與器材操作步驟結(jié)果判斷注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)討論教學(xué)內(nèi)容第四十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日一、中性粒細(xì)胞吞噬功能測(cè)定第四十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

觀察細(xì)胞吞噬現(xiàn)象，熟悉中性粒細(xì)胞吞噬作用的原理和檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡谒氖唔?，共一百五十頁?022年，8月28日

根據(jù)中性粒細(xì)胞具有吞噬功能，將吞噬細(xì)胞與細(xì)菌等顆粒性異物混合孵育一定時(shí)間后，推片、染色，于油鏡下觀察細(xì)胞吞噬細(xì)菌的情況，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。實(shí)驗(yàn)原理第四十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1．白色葡萄球菌懸液濃度5×108/ml，置4℃?zhèn)溆谩?．肝素抗凝管(含20U/ml肝素20μl)。3．Hanks液。4.瑞氏染液、75%酒精、碘酒、香柏油。5.器材水浴箱、37℃溫箱、顯微鏡、滴管、一次性采血針、試管、玻片、微量移液器、無菌干棉球、洗耳球、接種環(huán)等。試劑與器材

第四十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

操作步驟全血與菌液混勻1.用碘酒和酒精棉球先后消毒采血針和無名指。2.用一次性采血針刺破消毒部位皮膚，取40μl血加入肝素抗凝管中。3.用滴管取一滴菌液加入血試管中，輕搖混勻。第五十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日4.取輕輕取出試管，用微量移液器從試管底部細(xì)胞層吸取5μl于載玻片上，用另一載玻片推成薄血片，晾干。5.將瑞氏染液滴于上述血片，先染30～60s。然后加等量蒸餾水，用洗耳球吹打混勻，繼續(xù)染10～15min.6.水洗，晾干后油鏡下觀察。第五十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日中性粒細(xì)胞吞噬時(shí)，可見細(xì)胞核與被吞噬的細(xì)菌均染成紫色，而細(xì)胞漿則為淡紅色。結(jié)果判斷第五十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日結(jié)果判斷第五十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.所用器材要潔凈、無油污。2.白色葡萄球菌懸液中若含有10%的小牛血清，可提高吞噬率和吞噬指數(shù)。3.吞噬細(xì)菌的中性粒細(xì)胞往往在血片的尾部較多，因此計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)取血片的前、中、后三段計(jì)數(shù)，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。注意事項(xiàng)第五十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌時(shí)，有時(shí)難以計(jì)數(shù)吞入的細(xì)菌顆粒。試討論可從哪些方面改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，方便計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)？2.在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng)可減少實(shí)驗(yàn)誤差？實(shí)驗(yàn)討論第五十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

二、巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定

第五十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

熟悉小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備方法。了解巨噬細(xì)胞吞噬作用的原理和檢測(cè)方法。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡谖迨唔?，共一百五十頁?022年，8月28日

巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的吞噬異物及細(xì)菌的功能，在體內(nèi)外均能吞噬顆粒物質(zhì)。將巨噬細(xì)胞與雞紅細(xì)胞（CRBC）混合后孵育一定時(shí)間后，觀察巨噬細(xì)胞吞噬CRBC的百分率和吞噬指數(shù)，可了解其吞噬功能。實(shí)驗(yàn)原理第五十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小白鼠，7周齡左右，體重18～22g，雌雄不限。2.5%淀粉肉湯。3.2%雞紅細(xì)胞（CRBC）懸液。4.瑞氏染液、75%酒精、碘酒、香柏油。5.器材一次性注射器、有齒鑷、吸管、手術(shù)剪、解剖盤、試管、恒溫水浴箱、玻片、離心機(jī)、顯微鏡等。試劑與器材第五十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

操作步驟1．在實(shí)驗(yàn)前3d，自小鼠腹腔注射

5％淀粉肉湯溶液1ml/只，以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞游離至腹腔。2．實(shí)驗(yàn)時(shí)，經(jīng)腹腔給小鼠注射

2％雞紅細(xì)胞懸液lml，輕揉小鼠腹部，使懸液分散。3.30min后，麻醉處死小鼠。第六十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日4.將小鼠置于解剖盤中，常規(guī)消毒后，先剪開腹部皮膚，然后提起腹壁斜剪一小口，用不裝針頭的注射器或吸管吸取腹腔液。第六十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

5.將收集的腹腔液置于離心管中，以1500rpm離心10min。6.棄上清，吸取沉淀細(xì)胞涂片，待自然干燥。7.將瑞氏染液滴于上述涂片，先染30～60s。然后加等量蒸餾水，用洗耳球吹打混勻，繼續(xù)染10～15min，水洗，晾干后油鏡下觀察。第六十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日油鏡下可見圓形或不規(guī)則形狀核呈藍(lán)紫色的巨噬細(xì)胞，CRBC多為橢圓形胞漿呈淡紫紅色有核的細(xì)胞。結(jié)果判斷第六十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

被吞噬消化的雞紅細(xì)胞核模糊，核腫脹，染色淡，胞質(zhì)淺染，胞核呈淺灰黃色。第六十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日結(jié)果判斷第六十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.腹腔注射CRBC后，要注意掌握好吞噬作用時(shí)間。時(shí)間太長(zhǎng)CRBC可被消化，時(shí)間過短則尚未被吞噬。2.剪開小鼠腹腔吸取腹腔液時(shí)應(yīng)避免出血，否則將影響試驗(yàn)結(jié)果。3.涂片的薄厚要適當(dāng)，否則將影響結(jié)果觀察。注意事項(xiàng)第六十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.為何在實(shí)驗(yàn)前3d要給小白鼠腹腔注射6%淀粉肉湯，有何作用？2.臨床上若需要檢測(cè)巨噬細(xì)胞功能，應(yīng)如何采集人巨噬細(xì)胞？實(shí)驗(yàn)討論：福建醫(yī)科大學(xué)陳敏第六十七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)四血清總補(bǔ)體活性測(cè)定（驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)）第六十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理試劑與器材操作步驟結(jié)果判斷注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)討論教學(xué)內(nèi)容：第六十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

觀察血清補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血現(xiàn)象，了解補(bǔ)體系統(tǒng)在免疫反應(yīng)過程中的效應(yīng)作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡谄呤?，共一百五十頁?022年，8月28日綿羊紅細(xì)胞（SRBC）與相應(yīng)抗體（溶血素）結(jié)合形成的致敏紅細(xì)胞可通過經(jīng)典活化途徑激活補(bǔ)體，從而導(dǎo)致SRBC溶解。當(dāng)紅細(xì)胞與溶血素的濃度恒定時(shí)，在規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，補(bǔ)體的量及其活性與溶血程度正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)原理第七十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日溶血程度與補(bǔ)體含量的關(guān)系

由于溶血程度在30%～70%時(shí)，補(bǔ)體的用量稍有變化就會(huì)對(duì)溶血程度產(chǎn)生很大的影響，所以通常以50%溶血程度（CH50）作為判定反應(yīng)終點(diǎn)的指標(biāo)，而不用100%溶血程度。第七十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.巴比妥緩沖液（BBS，pH7.4）。2.2%SRBC懸液。3.溶血素（抗SRBC抗體）按效價(jià)用BBS稀釋至2個(gè)單位。4.待檢血清、生理鹽水、17g/L高滲鹽水。5.器材離心機(jī)、試管、刻度吸管、恒溫水浴箱、721分光光度計(jì)、比色杯等。試劑與器材

第七十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日

操作步驟：

1.稀釋待檢血清吸取新鮮待檢血清0.2ml，加入BBS3.8ml，將血清進(jìn)行1:20稀釋。2.制備50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管吸取2%SRBC懸液0.5ml，加蒸餾水2.0ml，混勻使紅細(xì)胞全部溶解，為100%溶血管；加入17g/L高滲鹽水2.0ml使之成為等滲溶液，再加入2%SRBC懸液0.5ml，即成為50%溶血管。第七十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日3.取試管10支按順序編號(hào)，然后按照下表所示加入各試劑，將各管混勻，置37℃水浴30min后測(cè)定補(bǔ)體活性。試管號(hào)BBS緩沖液（ml）1:20稀釋血清（ml）2%SRBC（ml）2U溶血素（ml）補(bǔ)體溶血活性（U/ml）1

1.400.100.5

0.537℃水浴30min2002

1.350.150.5

0.51333

1.300.200.5

0.51004

1.250.250.5

0.5805

1.200.300.5

0.566.66

1.150.350.5

0.557.17

1.100.400.5

0.5508

1.050.450.5

0.544.49

1.000.500.5

0.54010

1.500.000.5

0.5-第七十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日結(jié)果判斷4.將各反應(yīng)管經(jīng)2500r/min離心5min分光光度計(jì)波長(zhǎng)542nm比色血清總補(bǔ)體活性（CH50U/ml）＝1/血清用量(ml)×血清稀釋倍數(shù)選擇溶血程度與標(biāo)準(zhǔn)管最接近的管第七十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.待檢血清應(yīng)無溶血、無污染、無乳糜血。2.待檢血清必須新鮮，如放置室溫2h以上，可使補(bǔ)體活性下降。3.補(bǔ)體性質(zhì)不穩(wěn)定，其溶血活性可受多種因素的影響，因此，緩沖液、綿羊紅細(xì)胞等試劑應(yīng)新鮮配制，所用實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)清潔，殘留的酸堿等化學(xué)物質(zhì)均可使補(bǔ)體受破壞。注意事項(xiàng)第七十七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日4.綿羊紅細(xì)胞濃度和溶血素的量應(yīng)盡可能準(zhǔn)確。否則可直接影響溶血程度。當(dāng)用高濃度溶血素致敏時(shí)，溶血程度則隨紅細(xì)胞濃度的增加而增加。紅細(xì)胞濃度增加一倍，可使50%溶血補(bǔ)體量增加25%左右。注意事項(xiàng)第七十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.補(bǔ)體的溶血活性為何以50%溶血程度（CH50）作為判定反應(yīng)終點(diǎn)的指標(biāo)，而不用100%溶血程度？2.哪些因素可造成CH50結(jié)果發(fā)生偏差？實(shí)驗(yàn)討論福建醫(yī)科大學(xué)陳敏第七十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日白細(xì)胞殺菌能力測(cè)定（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）第八十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日白細(xì)胞殺菌能力主要檢測(cè)外周血中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞的吞噬和殺菌功能。第八十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)基本原理及背景知識(shí)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)要求實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)策略實(shí)驗(yàn)注意要點(diǎn)設(shè)計(jì)方案的總結(jié)和討論教學(xué)內(nèi)容第八十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日自主設(shè)計(jì)并完成實(shí)驗(yàn)全過程觀察白細(xì)胞的吞噬功能及其代謝變化熟悉與白細(xì)胞殺菌能力相關(guān)的指標(biāo)學(xué)會(huì)分析并探討胞內(nèi)殺菌機(jī)制實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡诎耸摚惨话傥迨摚?022年，8月28日吞噬細(xì)胞可通過趨化、調(diào)理、吞噬和殺傷等步驟清除病原體、死亡細(xì)胞等異物，是機(jī)體非特異免疫的重要組成部分。與細(xì)胞吞噬過程相關(guān)的趨化、吞噬、呼吸爆發(fā)、脫顆粒等任何階段功能缺陷均可影響吞噬細(xì)胞的殺菌活性。實(shí)驗(yàn)基本原理及背景知識(shí)第八十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日白細(xì)胞殺菌能力的檢測(cè)方法：

1.NBT還原試驗(yàn)

2.細(xì)菌計(jì)數(shù)法

3.化學(xué)發(fā)光法實(shí)驗(yàn)基本原理及背景知識(shí)

第八十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、基本原理以及所提供的?shí)驗(yàn)條件,自主設(shè)計(jì)1～2種檢測(cè)白細(xì)胞殺菌功能的實(shí)驗(yàn)方案。闡明實(shí)驗(yàn)原理、觀察指標(biāo)、操作步驟和實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)。按最佳實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案完成實(shí)驗(yàn)全過程，完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并進(jìn)行結(jié)果分析與總結(jié)。實(shí)驗(yàn)要求第八十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.NBT還原試驗(yàn)設(shè)計(jì)策略當(dāng)細(xì)菌感染時(shí)，中性粒細(xì)胞在吞噬殺菌過程中發(fā)生呼吸爆發(fā)，糖代謝活性增強(qiáng)。此時(shí)，被吞噬進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)淡黃色的NBT，可被細(xì)胞糖氧化過程中所脫的氫還原成藍(lán)紫色的甲臜(formazan)，以折光性很強(qiáng)的點(diǎn)狀或斑塊狀顆粒沉積于胞漿內(nèi)。在鏡下檢測(cè)NBT陽性細(xì)胞數(shù)量，可推知中性粒細(xì)胞的殺菌功能。第八十七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日2.細(xì)菌計(jì)數(shù)法設(shè)計(jì)策略將一定量的白細(xì)胞與細(xì)菌按比例混合、培養(yǎng)。作用一段時(shí)間之后，在培養(yǎng)體系中加入抗生素殺死胞外細(xì)菌，而吞入胞內(nèi)的細(xì)菌則不被抗生素殺滅。定時(shí)取樣，將白細(xì)胞溶解，釋放出胞內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的菌落即可直接判斷中性粒細(xì)胞的殺菌功能。第八十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日3.化學(xué)發(fā)光法設(shè)計(jì)策略當(dāng)中性粒細(xì)胞在吞噬細(xì)菌過程中，隨著呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量活性氧代謝產(chǎn)物，包括過氧化氫、超氧陰離子、羥自由基等，后者又能激發(fā)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，細(xì)胞的殺菌能力與發(fā)光強(qiáng)度相平行。因此可通過化學(xué)發(fā)光儀測(cè)量發(fā)光信號(hào)，從而推算細(xì)胞吞噬殺菌功能。第八十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.實(shí)驗(yàn)用的無菌試管、離心管、吸管等應(yīng)使用硅油處理，以防止細(xì)菌和白細(xì)胞黏附。2.要設(shè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照，以排除因細(xì)胞溶解或其他原因釋放的酶所引起的非特異性反應(yīng)。3.NBT還原與被吞噬過程在時(shí)間上是一致的，因此要注意控制白細(xì)胞與染料的時(shí)間(<30min)，以便得到準(zhǔn)確的結(jié)果。注意要點(diǎn)第九十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日4.NBT染料在鹽水中不易溶解，故配制NBT原液時(shí)要過濾去除未溶解的NBT顆粒，否則將被吞噬細(xì)胞吞噬，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。5.發(fā)光劑要注意4℃、避光保存。注意要點(diǎn)第九十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日NBT還原試驗(yàn)是臨床上常用的檢測(cè)的方法。具有操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，但特異性差，影響因素多，容易出現(xiàn)假陰性或假陽性。試討論NBT試驗(yàn)的原理及其臨床意義?？偨Y(jié)和討論第九十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日細(xì)菌計(jì)數(shù)法是檢測(cè)中性粒細(xì)胞胞內(nèi)殺菌能力的最直接方法，可用于診斷慢性肉芽腫、髓過氧化物酶缺陷癥等中性粒細(xì)胞殺菌功能缺陷病。但該法操作麻煩、費(fèi)時(shí)，臨床較少應(yīng)用?；瘜W(xué)發(fā)光法可在生理溫度和中性環(huán)境下測(cè)定，能較好地反映生理?xiàng)l件下吞噬細(xì)胞的功能，具有準(zhǔn)確靈敏、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)。其敏感性高于NBT還原試驗(yàn)。福建醫(yī)科大學(xué)陳敏第九十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日流式細(xì)胞分析系統(tǒng)（臨床見習(xí)）第九十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日流式細(xì)胞分析：是以流式細(xì)胞儀（FCM）為檢測(cè)手段的一種能高速精確地對(duì)單個(gè)細(xì)胞的理化及生物學(xué)特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析的先進(jìn)技術(shù)。

第九十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日特點(diǎn)：

單個(gè)細(xì)胞分析速度快多參數(shù)靈敏度高準(zhǔn)確性好第九十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日臨床分析型流式細(xì)胞儀

綜合

(分選)型類型第九十七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕驹硪娏?xí)內(nèi)容見習(xí)報(bào)告教學(xué)內(nèi)容第九十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日熟悉FCM的工作原理和技術(shù)流程。了解FCM在血液學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、腫瘤生物學(xué)等學(xué)科中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡诰攀彭?，共一百五十頁?022年，8月28日基本原理FCM在熒光標(biāo)記探針協(xié)助下，對(duì)懸浮的單個(gè)細(xì)胞或微粒表面或內(nèi)部的化學(xué)成分特性進(jìn)行快速分析或純化分選。第一百頁，共一百五十頁，2022年，8月28日流動(dòng)室計(jì)算機(jī)系統(tǒng)處理、分析散射光和特定的熒光信號(hào)待測(cè)樣品制備細(xì)胞排成單列激光檢測(cè)區(qū)先制備待測(cè)的單細(xì)胞懸液，經(jīng)過熒光抗體標(biāo)記后，讓待測(cè)細(xì)胞在氣體壓力的驅(qū)動(dòng)下流經(jīng)充滿鞘流的流動(dòng)室。細(xì)胞排成單列逐個(gè)依次通過激光檢測(cè)區(qū)。被熒光染色的細(xì)胞在垂直入射的激光束照射下，產(chǎn)生了細(xì)胞的散射光信號(hào)和特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。單細(xì)胞懸液熒光抗體標(biāo)記光電倍增管第一百零一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日通過不同的檢測(cè)器和特定波長(zhǎng)選擇通透性的濾光片，可獲得不同方向的散射光和不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)來，經(jīng)過一系列的的光電倍增管放大后，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)收集、數(shù)字化處理，最后通過計(jì)算機(jī)軟件分析結(jié)果。第一百零二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日基本原理

單細(xì)胞液流柱

流動(dòng)室振動(dòng)

液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴廢液容器偏轉(zhuǎn)落入收集器超聲壓電晶體高頻振動(dòng)

不充電充電細(xì)胞分選是通過分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。第一百零三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日FCM的結(jié)構(gòu)及主要部件樣品制備免疫熒光標(biāo)記方法技術(shù)流程質(zhì)量控制設(shè)備維護(hù)結(jié)果判定見習(xí)內(nèi)容

第一百零四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日流式細(xì)胞儀目前臨床型流式細(xì)胞儀主要有FACSCalibur、EPICSXL和CytomicsFC500，兩家公司的儀器在使用上有所不同。EPICSXLCytomicsFC500FACSCalibur第一百零五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日1.液流系統(tǒng)2.光學(xué)系統(tǒng)3.計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)FCM的基本結(jié)構(gòu)及部件第一百零六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日噴嘴熒光信號(hào)激光束鞘液液流系統(tǒng)第一百零七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管鞘液管第一百零八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日FS前向角散射光檢測(cè)器SS側(cè)向角散射光檢測(cè)器FL1熒光檢測(cè)器液滴激光束光學(xué)系統(tǒng)FL2熒光檢測(cè)器FL3熒光檢測(cè)器FL4熒光檢測(cè)器第一百零九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日散射光信號(hào):FS：反映顆粒的大小

SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度熒光信號(hào)FL1-FL4：反映細(xì)胞或顆粒上熒光量的多少數(shù)據(jù)參數(shù)第一百一十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日主要由計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理及分析軟件組成，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析、存儲(chǔ)與顯示。計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)第一百一十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日單參數(shù)直方圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖二維等高圖假三維等高圖數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式三參數(shù)散點(diǎn)圖第一百一十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日單參數(shù)直方圖：由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成。橫軸為該參數(shù)測(cè)量強(qiáng)度相對(duì)值，單位是道數(shù)?？v軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。數(shù)據(jù)顯示方式第一百一十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日雙參數(shù)散點(diǎn)圖：X軸代表第一個(gè)測(cè)量參數(shù)Y軸代表第二個(gè)測(cè)量參數(shù)每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)顯示方式第一百一十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日二維等高圖：用等高線來表示細(xì)胞數(shù)在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同數(shù)據(jù)顯示方式第一百一十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日假三維等高圖：縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù),Z軸為細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)顯示方式FSSS第一百一十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日三參數(shù)散點(diǎn)圖：三維坐標(biāo)均為參數(shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)顯示方式FSCD45-FITCCD34-PE第一百一十七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日Gate設(shè)置：指在某張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)其細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并使該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。設(shè)門分析技術(shù)第一百一十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日線性門矩形門圓形門十字門

多邊形門任意形狀門設(shè)門分析技術(shù)根據(jù)門的形狀分為：第一百一十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日外周血骨髓組織塊培養(yǎng)細(xì)胞脫落細(xì)胞。常用抗凝劑：EDTA：2mg/ml枸椽酸鈉：0.38%肝素：15IU/ml樣品制備

標(biāo)本來源：標(biāo)本濃度：?jiǎn)渭?xì)胞懸液：106個(gè)／ml第一百二十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日熒光素在流式細(xì)胞儀上的檢測(cè)通道

FITC，GFP，AlexaFluor?488，YFP,CFSE,VybrantGreen，PKH67PE，YFP,PKH26,DsRed,Vybrantorange,PIPE-TexasRed，PE-Cy5，PerCP，PerCP-Cy5.5，PE-Cy7APC，Alexa647FL1FL2FL3FL4常用的熒光染料常用的熒光染料FITC，AlexaFluor488,GFP,YFP,CFSE,VybrantGreen，PKH67PE，YFP,PKH26,DsRed,Vybrantorange,PIECD,PI,AlexaFluor594,PE-AF610PE-Cy5,PerCP7-AADFL1FL2FL3FL4PE-Cy7FL5BDFACSCalibur的熒光通道BeckmanCoulterCytomicsFC500的熒光通道第一百二十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日技術(shù)流程

（1）分別將鞘液盒及清潔液盒加滿，廢液桶倒凈。（2）依次開啟總電源、計(jì)算機(jī)、顯示屏。（3）打開電源箱門，檢查：WATERTRAP液體不能超過1/3VACUUMTRAP液體不能超過1/4AIRFILTER與VACUUMFILTER必需干燥無水1.開機(jī)程序第一百二十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日技術(shù)流程

（4）檢查SYSTEMVACUUM表，負(fù)壓應(yīng)在-17~30in.Hg之間。（5）檢查SYSTEMPRESURE表，調(diào)節(jié)壓力為28~32PSI之間。（6）確認(rèn)儀器LASERON燈亮。（7）確認(rèn)儀器啟動(dòng)10~30min后READY燈亮（綠色）。（8）確保LASERHEAD的風(fēng)冷氣流通暢。1.開機(jī)程序第一百二十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日技術(shù)流程

（9）檢查樣品進(jìn)樣頭有負(fù)壓。(10)確認(rèn)計(jì)算機(jī)屏幕無顯示異常的報(bào)警。

(11)選擇檢測(cè)FlowCheck的PROTOCOL(方案)進(jìn)行光路與流路的檢測(cè)、校準(zhǔn)。

(

12)選擇Flow-SetProtocol校準(zhǔn)光電倍增管，調(diào)試儀器進(jìn)入最佳檢測(cè)狀態(tài)。1.開機(jī)程序第一百二十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日(1)選擇待測(cè)參數(shù)于屏幕右下方用鼠標(biāo)將需要的參數(shù)點(diǎn)成黃色。選擇參數(shù)后，可利用屏幕右上方的UserName

將所選擇的信號(hào)改成用戶需要的名稱。(2)利用參數(shù)建立直方圖用鼠標(biāo)將屏幕右上方的參數(shù)點(diǎn)亮，然后放在直方圖的X、Y軸，創(chuàng)建需要的直方圖。2.選擇相應(yīng)的PROTOCOL或新建方案第一百二十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日(3)界定每張直方圖的分析區(qū)域單參數(shù)直方圖分析區(qū)種類：線性(Lin)

雙參數(shù)直方圖分析區(qū)種類：矩形(Rec)任意形(Amo)十字形(Qua)

數(shù)字形(Num)：在單參數(shù)直方圖中為線性在雙參數(shù)直方圖中為矩形。第一百二十六頁，共一百五十頁，2022年，8月28日(4)利用GATING建立直方圖之間的關(guān)系在設(shè)立分析區(qū)域的界面下，返回多張直方圖顯示狀態(tài)。選擇所要的分析區(qū)域，將其點(diǎn)亮，放在所要的GATING直方圖上方。(5)選擇數(shù)據(jù)采集的停止方式、存儲(chǔ)方式、打印方式。第一百二十七頁，共一百五十頁，2022年，8月28日（6）存貯方案SAVEAS文件名。（7）運(yùn)行待測(cè)標(biāo)本，調(diào)整以下儀器參數(shù)：

PMT(光電倍增管)、電壓(Volts)

增益(Gain)、檢測(cè)速度(FlowRate)

閾值(Discriminator)

顏色補(bǔ)償(ColorCompensation)

（8）重新存儲(chǔ)方案，將原方案覆蓋。第一百二十八頁，共一百五十頁，2022年，8月28日（1）選擇預(yù)先存儲(chǔ)的方案。（2）儀器提示InsertSampleTube。（3）將陰性對(duì)照的樣本管放入樣本臺(tái)上，儀器會(huì)自動(dòng)檢測(cè)樣本管并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。3.標(biāo)本測(cè)定第一百二十九頁，共一百五十頁，2022年，8月28日（4）電壓的調(diào)整用鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊FASTSET，出現(xiàn)十字標(biāo)記后，將鼠標(biāo)移至所需調(diào)整的細(xì)胞群，按住左鍵進(jìn)行調(diào)整，松開左鍵后,儀器會(huì)自動(dòng)重新進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，相應(yīng)的電壓及增益值會(huì)隨之改變。（5）樣本測(cè)試與上述相同條件下，上樣品管進(jìn)行樣本測(cè)試。若為雙色以上分析，注意調(diào)整顏色補(bǔ)償。第一百三十頁，共一百五十頁，2022年，8月28日（6）調(diào)整顏色補(bǔ)償：用鼠標(biāo)點(diǎn)擊FASTCOMP將鼠標(biāo)移置所需補(bǔ)償?shù)募?xì)胞群，拖至正常位置。第一百三十一頁，共一百五十頁，2022年，8月28日用計(jì)算機(jī)工作軟件將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除，自動(dòng)校正熒光染料光譜之間疊加所造成的誤差。第一百三十二頁，共一百五十頁，2022年，8月28日（1）選擇已儲(chǔ)存的文件。（2）將文件及圖形打開。（3）在原有參數(shù)的基礎(chǔ)上重新建立直方圖，設(shè)立直方圖打印方式。4.結(jié)果分析第一百三十三頁，共一百五十頁，2022年，8月28日質(zhì)量控制儀器設(shè)備樣本處理試劑操作過程數(shù)據(jù)分析第一百三十四頁，共一百五十頁，2022年，8月28日主要包括：流路和光路的穩(wěn)定性熒光顏色補(bǔ)償光電倍增管轉(zhuǎn)換的線性和穩(wěn)定性1.儀器的校準(zhǔn)第一百三十五頁，共一百五十頁，2022年，8月28日（1）光路與流路校準(zhǔn)

可使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球（FlowCheck

）對(duì)儀器的光路與樣品流進(jìn)行校準(zhǔn)驗(yàn)證，將變異系數(shù)調(diào)整到最小范圍。①將FlowCheck在室溫下放10min。②選擇檢測(cè)FlowCheck的ROTOCOL。③取0.5ml(15～20滴)FlowCheck放入試管中。④將試管放在樣品臺(tái)上進(jìn)樣檢測(cè)，取數(shù)5000(FS)。⑤記錄FS及熒光FL1～FL4的HPCV值，核對(duì)是否<2