細(xì)胞工程植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn)

細(xì)胞工程植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn)第一頁，共八十二頁，2022年，8月28日課程初步安排：36學(xué)時(shí)

第一章緒論4個(gè)學(xué)時(shí)

第二章實(shí)驗(yàn)室配置及基本技術(shù)2個(gè)學(xué)時(shí)

第三章植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)4個(gè)學(xué)時(shí)

第四章植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)6個(gè)學(xué)時(shí)

第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)3個(gè)學(xué)時(shí)

第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交3個(gè)學(xué)時(shí)

第七章人工種子1個(gè)學(xué)時(shí)

第八章植物種質(zhì)資源離體超低溫保存1個(gè)學(xué)時(shí)

第九章動(dòng)物組織培養(yǎng)3個(gè)學(xué)時(shí)

第十章動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體4個(gè)學(xué)時(shí)

第十一章動(dòng)物組織與胚胎工程1個(gè)學(xué)時(shí)

第十二章試管動(dòng)物與克隆動(dòng)物2個(gè)學(xué)時(shí)

第二頁，共八十二頁，2022年，8月28日第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

植物細(xì)胞培養(yǎng)(plantcellculture)指在離體條件下對(duì)植物單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)使其增殖的技術(shù)。第三頁，共八十二頁，2022年，8月28日根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模不同----

小規(guī)模培養(yǎng)、大批量培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)方式不同----

懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)等根據(jù)培養(yǎng)的目的不同----

用于誘變或用于生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)第四頁，共八十二頁，2022年，8月28日一懸浮培養(yǎng)二單細(xì)胞培養(yǎng)三細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)四培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝及產(chǎn)物積累第五頁，共八十二頁，2022年，8月28日一懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。在液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細(xì)胞狀態(tài)可以保持一致有利于在細(xì)胞水平上進(jìn)行各種遺傳操作和生理生化活動(dòng)研究為植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供前期技術(shù)基礎(chǔ)第六頁，共八十二頁，2022年，8月28日CellsuspensionArtificialseedsPlantsIsolationprotoplastsSecondaryproductsMutationselect第七頁，共八十二頁，2022年，8月28日

愈傷組織誘導(dǎo)

懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的調(diào)控以愈傷組織為起始細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)其過程：第八頁，共八十二頁，2022年，8月28日（一）愈傷組織誘導(dǎo)

要求松散型好、增殖快、再生能力強(qiáng)。外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎。第九頁，共八十二頁，2022年，8月28日選擇適宜的植物外植體材料--研究表明，胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體選擇適宜的培養(yǎng)基--較高濃度激素如2,4-D，必要的附加物質(zhì)如CH等愈傷組織培養(yǎng)--進(jìn)行必要的選擇和繼代第十頁，共八十二頁，2022年，8月28日（二）懸浮細(xì)胞系的建立與繼代培養(yǎng)

1、取一定量的愈傷組織放入盛有液體培養(yǎng)基的三角瓶中；2、接種后的三角瓶置于120r/min的搖床上，在室溫下黑暗培養(yǎng)；3、培養(yǎng)初期，每隔3d左右更換1次新鮮培養(yǎng)基；4、懸浮細(xì)胞系建立，經(jīng)一段時(shí)間培養(yǎng)，每隔1～2周需繼代一次，可采用蔗糖梯度離心法先進(jìn)行篩選；5、懸浮細(xì)胞系穩(wěn)定后，繼代培養(yǎng)中的振蕩頻率可適當(dāng)降低。callus10mlmedium/1gcentrifugationisolation120rpmculturetrasfer1time/3d

150/250mlflask80rpmsubculture第十一頁，共八十二頁，2022年，8月28日懸浮細(xì)胞系的建立與繼代培養(yǎng)

第十二頁，共八十二頁，2022年，8月28日

一個(gè)成功的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系應(yīng)當(dāng)滿足3個(gè)基本條件：--懸浮培養(yǎng)物分散性良好,細(xì)胞團(tuán)較小，一般30～50個(gè)細(xì)胞以下--均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同--生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般2～3天便可增加1倍第十三頁，共八十二頁，2022年，8月28日LagCellNumberTime(Day)ExponentialLinearProgressiveDecelerationStationary懸浮細(xì)胞在一個(gè)培養(yǎng)周期中細(xì)胞增長(zhǎng)動(dòng)態(tài)1、懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)（三）細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的調(diào)控第十四頁，共八十二頁，2022年，8月28日

根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)變化或細(xì)胞重量變化，即可構(gòu)成該培養(yǎng)體系的基本參數(shù)

生長(zhǎng)速率ρ一般通過不同時(shí)間細(xì)胞密度χ的自然對(duì)數(shù)與起始密度χ0

的自然對(duì)數(shù)之差與培養(yǎng)時(shí)間τ的比來衡量ρ=（lnx-lnx0）/t

也可通過單位體積的細(xì)胞重量測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞重量采用鮮重和干重衡量。一般鮮重只能反應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，而干重則一定程度上反映了細(xì)胞質(zhì)量。鮮重和干重的測(cè)定方法較簡(jiǎn)單，只需按一定體積取樣經(jīng)過真空過濾后稱重即可得到鮮重，然后在80℃條件下烘干細(xì)胞至恒重即獲得細(xì)胞干重。第十五頁，共八十二頁，2022年，8月28日

影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：--起始愈傷組織的質(zhì)量--接種細(xì)胞密度--培養(yǎng)條件第十六頁，共八十二頁，2022年，8月28日2、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化

細(xì)胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。第十七頁，共八十二頁，2022年，8月28日--植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中的游離性較差，容易團(tuán)聚并進(jìn)入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達(dá)到完全同步化對(duì)于植物細(xì)胞培養(yǎng)是十分困難的--正是因?yàn)橥慌囵B(yǎng)體系的植物細(xì)胞通常并不能處于同一細(xì)胞周期，這種差異使懸浮細(xì)胞的分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等更趨復(fù)雜化--目前，通過一些物理和化學(xué)處理，可以使同一體系中的細(xì)胞達(dá)到相對(duì)同步化第十八頁，共八十二頁，2022年，8月28日饑餓法：在一個(gè)培養(yǎng)體系中，如果細(xì)胞生長(zhǎng)的基本成分喪失，則導(dǎo)致細(xì)胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時(shí)期；在培養(yǎng)基中加入所缺乏的成分或者將饑餓細(xì)胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞分裂又可重新恢復(fù)。

饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞分裂受阻常常是使細(xì)胞不能合成DNA，即不能進(jìn)入S期或細(xì)胞分裂不能進(jìn)行，即不能進(jìn)入M期。因此通過饑餓法可獲得處于G1和G2期的同步化細(xì)胞

研究顯示，當(dāng)細(xì)胞處于氮饑餓時(shí)，通常獲得G1期的同步化細(xì)胞，而當(dāng)細(xì)胞處于磷和碳饑餓時(shí)，通常獲得G1和G2期的同步化細(xì)胞第十九頁，共八十二頁，2022年，8月28日抑制劑法：通過一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后即可獲得處于同一細(xì)胞周期－G1期的同步化細(xì)胞。

常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷（FdU）和羥基尿（HU）通過抑制劑獲得的同步化細(xì)胞基本處于同一個(gè)細(xì)胞周期，在除去抑制劑后可以不進(jìn)行分選直接培養(yǎng)，是一種簡(jiǎn)單便利的方法第二十頁，共八十二頁，2022年，8月28日分選法：是通過細(xì)胞體積大小分級(jí)，直接將處于相同細(xì)胞周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中，則可能保持相同培養(yǎng)體系中的細(xì)胞具有較好一致性。

該方法操作簡(jiǎn)單，分選細(xì)胞維持了自然生長(zhǎng)狀態(tài)，不會(huì)有其它處理方法所帶來的對(duì)細(xì)胞活力的影響；但細(xì)胞分選的精細(xì)程度較差常規(guī)的細(xì)胞分選是采用梯度離心的方法，有時(shí)也采用篩網(wǎng)過濾法和梯度離心相結(jié)合的方法獲得同步化細(xì)胞系；精細(xì)的分選可采用流式細(xì)胞儀第二十一頁，共八十二頁，2022年，8月28日低溫處理：冷處理也可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度。Okamura等曾采用此途徑使胡蘿卜懸浮細(xì)胞較好的同步化，而梅興國(guó)等采用6℃低溫處理紅豆杉細(xì)胞也獲得較明顯的同步化效果。第二十二頁，共八十二頁，2022年，8月28日二單細(xì)胞培養(yǎng)平板培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)微室培養(yǎng)

雙層濾紙培養(yǎng)第二十三頁，共八十二頁，2022年，8月28日（一）平板培養(yǎng)（platingculture)

平板培養(yǎng)是指將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。平板培養(yǎng)基上所得到的細(xì)胞團(tuán)是由一個(gè)單細(xì)胞增殖而來，是優(yōu)良單細(xì)胞株篩選的常用方法。

第二十四頁，共八十二頁，2022年，8月28日1、單細(xì)胞的分離：可采用酶分離法，現(xiàn)多采用經(jīng)培養(yǎng)的旺盛生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞系，通過過濾去除大的細(xì)胞團(tuán)，游離單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán);2、單細(xì)胞懸浮液的制備：過濾后的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次后再調(diào)整密度為5x105個(gè)/mL左右;3、植板：將1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度約為5mm左右。第二十五頁，共八十二頁，2022年，8月28日

平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量，植板率是指能長(zhǎng)出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例。

植板率=每個(gè)平板接種的細(xì)胞總數(shù)每個(gè)平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)X100%第二十六頁，共八十二頁，2022年，8月28日固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織；在愈傷組織上放一小片濾紙待濾紙濕潤(rùn)后將細(xì)胞接種于濾紙上；當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)出小細(xì)胞團(tuán)后將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長(zhǎng)。（二）看護(hù)培養(yǎng)(nurseculture)

第二十七頁，共八十二頁，2022年，8月28日（三）微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)（micro-chamberculture），指人工制造一個(gè)小室并將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室少量的培養(yǎng)基中，使其生長(zhǎng)增殖的方法。它實(shí)際上是一種微量細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，主要目的是進(jìn)行單細(xì)胞活體連續(xù)觀察。第二十八頁，共八十二頁，2022年，8月28日（四）雙層濾紙植板培養(yǎng)Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法。第二十九頁，共八十二頁，2022年，8月28日三細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)概述規(guī)?；囵B(yǎng)體系建立生物反應(yīng)器類型及其特點(diǎn)規(guī)模化培養(yǎng)的技術(shù)問題第三十頁，共八十二頁，2022年，8月28日（一）概述

在植物生物技術(shù)中，應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)合成有用的天然產(chǎn)物很可能發(fā)展為廣義的化學(xué)工業(yè)的一個(gè)組成部分。長(zhǎng)期以來，植物一直是許多化學(xué)品主要資源，特別是在制藥和食品加工業(yè)中更是不可缺少。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，至少有20%左右的藥物是由植物衍生而來的，而且每年都發(fā)現(xiàn)許多植物來源的新化合物。第三十一頁，共八十二頁，2022年，8月28日

植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義

李時(shí)珍（1593）在《本草綱目》中所開列的1892種藥物中絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25%的法定藥品來自植物，其藥物有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良食品添加劑和名貴化妝品原料；有些是生物毒素的主要來源，可用于殺蟲、殺菌而對(duì)環(huán)境和人畜無害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品。第三十二頁，共八十二頁，2022年，8月28日第三十三頁，共八十二頁，2022年，8月28日

規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)植物次生產(chǎn)物的理想途徑

保護(hù)生態(tài)環(huán)境提高生產(chǎn)效率發(fā)展新型生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)第三十四頁，共八十二頁，2022年，8月28日

自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較

生產(chǎn)方式

生產(chǎn)周期紫草寧含量（%干重）

完整植株

2～3年1～2

植物細(xì)胞培養(yǎng)3周14第三十五頁，共八十二頁，2022年，8月28日

植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求：

從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下三個(gè)條件：1、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物；2、細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成的速度快，在較短時(shí)間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物；3、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能夠釋放到培養(yǎng)基中。第三十六頁，共八十二頁，2022年，8月28日（二）植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立種子細(xì)胞的選擇種子細(xì)胞的增殖與放大培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立第三十七頁，共八十二頁，2022年，8月28日1、種子細(xì)胞的選擇外植體選擇高產(chǎn)細(xì)胞選擇第三十八頁，共八十二頁，2022年，8月28日外植體選擇植物類型：在確定生產(chǎn)某一種化合物以后首先必須準(zhǔn)確選擇那些能夠產(chǎn)生目的化合物的植物種類及其品種或單株。組織器官：起始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織為外植體。第三十九頁，共八十二頁，2022年，8月28日高產(chǎn)細(xì)胞系的選擇

懸浮細(xì)胞系

單細(xì)胞克隆根據(jù)成分含量分析

種子細(xì)胞增殖采用單細(xì)胞培養(yǎng)方法第四十頁，共八十二頁，2022年，8月28日為了提高篩選效率，還可根據(jù)后續(xù)的培養(yǎng)條件適當(dāng)增加選擇壓力，也可采用突變的方法進(jìn)行高產(chǎn)突變細(xì)胞系篩選。李志勇等（2002）直接利用起始培養(yǎng)細(xì)胞，挑選不同細(xì)胞團(tuán)建立了10個(gè)大蒜細(xì)胞懸浮系，比較研究顯示不同懸浮細(xì)胞系間SOD合成能力具顯著差異，合成能力最高的細(xì)胞系可達(dá)10.81x106U/L，最低只有2.37x106U/L梅興國(guó)等（2001）通過在培養(yǎng)基中添加1.6mM/L的L-Phe，篩選出了抗苯丙氨酸紅豆杉細(xì)胞系，抗苯丙氨酸細(xì)胞系的紫杉醇含量高于原型細(xì)胞系的3～5倍。第四十一頁，共八十二頁，2022年，8月28日2、種子細(xì)胞的增殖與放大培養(yǎng)--可獲得大量的活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞群體，為細(xì)胞大批量生產(chǎn)準(zhǔn)備基礎(chǔ)材料--為大體積反應(yīng)器培養(yǎng)提供技術(shù)參數(shù)第四十二頁，共八十二頁，2022年，8月28日種子細(xì)胞增殖初期一般采用液體振蕩培養(yǎng)，也稱搖瓶培養(yǎng)。其搖瓶體積一般從幾百毫升到幾升逐級(jí)放大。此過程中應(yīng)不斷檢測(cè)細(xì)胞放大培養(yǎng)中因培養(yǎng)體積的增加所引起的細(xì)胞生長(zhǎng)特性和目的產(chǎn)物含量的變化情況；細(xì)胞數(shù)量增加到一定數(shù)量后，應(yīng)轉(zhuǎn)移至體積較小的生物反應(yīng)器培養(yǎng)，模擬大規(guī)模培養(yǎng)控制條件。第四十三頁，共八十二頁，2022年，8月28日3、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立

植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，根據(jù)一個(gè)培養(yǎng)周期中是否添加培養(yǎng)基可分為成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)

基本培養(yǎng)方式的選擇應(yīng)根據(jù)次生產(chǎn)物積累特點(diǎn)而定，通常根據(jù)不同要求進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)。比如當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成需不同培養(yǎng)基時(shí)就要采用兩步法建立培養(yǎng)體系，先在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合成產(chǎn)物的階段后再將其轉(zhuǎn)入到產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在產(chǎn)物合成階段又可采用連續(xù)培養(yǎng)方式以延長(zhǎng)細(xì)胞生產(chǎn)時(shí)間。第四十四頁，共八十二頁，2022年，8月28日成批培養(yǎng)(batchculture)是指在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞和添加培養(yǎng)基后，中途不進(jìn)行添加或更換培養(yǎng)基的方式。

成批培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)裝置和操作簡(jiǎn)單，但在培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)物積累及培養(yǎng)基的物理狀態(tài)常隨時(shí)間變化而變化培養(yǎng)檢測(cè)十分困難。同時(shí)，成批培養(yǎng)的周期較短，一個(gè)培養(yǎng)周期后細(xì)胞和培養(yǎng)液可同時(shí)取出用于目的產(chǎn)物提取，下一個(gè)培養(yǎng)周期必須重新接種種子細(xì)胞因此也增加了培養(yǎng)成本。第四十五頁，共八十二頁，2022年，8月28日連續(xù)培養(yǎng)(continuousculture)是在培養(yǎng)過程中不斷向反應(yīng)器中流加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)液，從而維持培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)在細(xì)胞密度、產(chǎn)物濃度以及物理狀態(tài)相對(duì)平衡，這種方式即稱為連續(xù)培養(yǎng)。

連續(xù)培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是可以延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)周期，從而延長(zhǎng)目的產(chǎn)物積累時(shí)間，增加目的產(chǎn)物產(chǎn)量。同時(shí)，由于系統(tǒng)進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)后細(xì)胞密度、基質(zhì)、產(chǎn)物濃度等處于恒定，便于對(duì)系統(tǒng)的檢測(cè)。但連續(xù)培養(yǎng)裝置相對(duì)較復(fù)雜，對(duì)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)要求更高。第四十六頁，共八十二頁，2022年，8月28日半連續(xù)培養(yǎng)(semi-continuousculture)是一種介于成批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的培養(yǎng)方式。其基本方法是在完成上述成批培養(yǎng)的一個(gè)周期后，只從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，保留一小部分細(xì)胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基再進(jìn)行培養(yǎng)。

這種培養(yǎng)方式可以節(jié)省種子細(xì)胞培養(yǎng)的成本，同時(shí)保留的培養(yǎng)液也有利于細(xì)胞分裂啟動(dòng)。但大多數(shù)情況下，由于保留細(xì)胞懸液中細(xì)胞狀態(tài)有較大差異，特別是有些衰老細(xì)胞不能及時(shí)淘汰，從而會(huì)影響下一培養(yǎng)周期的細(xì)胞生長(zhǎng)一致性。第四十七頁，共八十二頁，2022年，8月28日（三）生物反應(yīng)器類型及特點(diǎn)

所謂生物反應(yīng)器是指高等生物細(xì)胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。

植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)，既要考慮有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，還要考慮有利于產(chǎn)物積累和分離?？傮w上講，適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有適宜的氧傳遞、良好的流動(dòng)性和較低的剪切力。第四十八頁，共八十二頁，2022年，8月28日第四十九頁，共八十二頁，2022年，8月28日1攪拌式反應(yīng)器固定化反應(yīng)器氣動(dòng)式反應(yīng)器第五十頁，共八十二頁，2022年，8月28日

機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器是根據(jù)植物細(xì)胞特性在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，適用范圍廣，混合程度高，但剪切力相對(duì)較大，中軸與罐體間易于泄露而污染；對(duì)攪拌漿的厚度、形狀及攪拌速度等方面進(jìn)行了改進(jìn)，可以降低剪切力。一般改葉輪式為螺旋式；植物細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，需要隨時(shí)補(bǔ)充水分和營(yíng)養(yǎng)，必須設(shè)計(jì)加液裝置。由于植物細(xì)胞的生理活動(dòng)需要新鮮空氣，而且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計(jì)通氣裝置；為便于取樣觀察，一般還設(shè)計(jì)有取樣口。

攪拌式生物反應(yīng)器第五十一頁，共八十二頁，2022年，8月28日

葉輪攪拌式第五十二頁，共八十二頁，2022年，8月28日氣動(dòng)式生物反應(yīng)器

考慮到機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切力作用難以避免，同時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點(diǎn)是攪拌不均勻。第五十三頁，共八十二頁，2022年，8月28日1、鼓泡式生物反應(yīng)器：通過反應(yīng)器底部的噴嘴以及多孔板實(shí)現(xiàn)氣體分散促進(jìn)培養(yǎng)容器的液體流動(dòng)。剪切力小，沒有運(yùn)動(dòng)部件因而操作不易污染、放大容易，但氧的利用率較低，混合不夠均勻，液體流動(dòng)與傳質(zhì)性能檢測(cè)困難。2、氣升式生物反應(yīng)器：通過空氣循環(huán)攪拌培養(yǎng)液，可保證良好的液體流動(dòng)性及較高的氧傳遞效果，反應(yīng)器結(jié)構(gòu)和操作相對(duì)較簡(jiǎn)單，近年來在植物細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)中廣泛使用。第五十四頁，共八十二頁，2022年，8月28日第五十五頁，共八十二頁，2022年，8月28日固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器細(xì)胞固定化培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)1、可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而可以研究特定的代謝途徑并便于調(diào)節(jié)；2、細(xì)胞位置的固定使其所處的環(huán)境類似于在植物體中所處的狀態(tài)，有利于次生產(chǎn)物的合成；3、可以從培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因含有過多初生產(chǎn)物而對(duì)細(xì)胞代謝的反饋抑制，延長(zhǎng)細(xì)胞生產(chǎn)周期同時(shí)可進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。

第五十六頁，共八十二頁，2022年，8月28日

細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)按照其支持物不同可以分為兩大類：1、包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng):系統(tǒng)支持物多采用瓊脂瓊脂糖、海藻酸鹽、聚丙烯酰胺等2、附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng):支持物多采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料第五十七頁，共八十二頁，2022年，8月28日

植物細(xì)胞固定化生物反應(yīng)器1填充床反應(yīng)器：細(xì)胞固定于支持物表面或內(nèi)部，支持物顆粒堆疊成床，培養(yǎng)基在床層間流動(dòng)。由于顆粒間的擠壓容易造成顆粒破碎使填充床阻塞，同時(shí)存在混合不均勻、床內(nèi)氧傳遞速率低的缺點(diǎn)。2流化床反應(yīng)器：反應(yīng)器中利用流質(zhì)的能量使支持物顆粒處于懸浮狀態(tài)，混合效果較好。但流體的切變力和顆粒的碰撞場(chǎng)造成破損使細(xì)胞外流，同時(shí)流體力學(xué)的復(fù)雜性也使其放大困難。3膜反應(yīng)器：采用具有一定孔徑和選擇性透性的膜來固定植物細(xì)胞相比說具有容易控制、易于放大、產(chǎn)物易分離等優(yōu)點(diǎn)，但由于膜材料的限制，成本較高。第五十八頁，共八十二頁，2022年，8月28日第五十九頁，共八十二頁，2022年，8月28日（四）植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)中的有關(guān)工程技術(shù)問題1、懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)必須適應(yīng)植物細(xì)胞特性3、植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中o2與co2調(diào)節(jié)4、泡沫和表面黏附性5、剪切力對(duì)植物細(xì)胞的影響2、植物細(xì)胞培養(yǎng)液的流變特性—黏度變化第六十頁，共八十二頁，2022年，8月28日

植物細(xì)胞體積大，其平均直徑比細(xì)菌大幾十倍。同時(shí)，植物細(xì)胞很少以單細(xì)胞形式懸浮生長(zhǎng)，通常是以2～200個(gè)細(xì)胞、直徑2mm大小的非均相小細(xì)胞團(tuán)方式存在；

植物細(xì)胞纖維素細(xì)胞壁使其抗剪切能力相當(dāng)弱；

植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，操作周期長(zhǎng)，培養(yǎng)基復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)成分有利于微生物生長(zhǎng)，植物細(xì)胞培養(yǎng)中維持無菌環(huán)境的難度較大但又十分重要。第六十一頁，共八十二頁，2022年，8月28日

培養(yǎng)液的黏度變化是由細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)變化引起的；煙草培養(yǎng)液的表觀黏度主要是由培養(yǎng)細(xì)胞密度引起的。當(dāng)細(xì)胞密度低于7g/L時(shí)，培養(yǎng)液的黏度基本保持不變，當(dāng)細(xì)胞密度高于此值時(shí)，培養(yǎng)液的黏度就增加；長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度在10g/L時(shí)，培養(yǎng)液屬于假塑性流體，此時(shí)，培養(yǎng)液的黏度依賴于細(xì)胞年齡、形態(tài)和細(xì)胞團(tuán)的大小。

在相同物質(zhì)濃度下，大細(xì)胞團(tuán)的營(yíng)養(yǎng)液表觀黏度明顯大于小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)液的表觀黏度。第六十二頁，共八十二頁，2022年，8月28日

體積氧傳遞系數(shù)(KLa，單位時(shí)間單位體積氧量)：如，在4L的氣升式反應(yīng)器中進(jìn)行長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，KLa在20h-1左右時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)與次生產(chǎn)物合成均維持在良好狀態(tài)；如，在15L的通風(fēng)式反應(yīng)器中培養(yǎng)的煙草細(xì)胞，KLa值在5～10h-1的范圍內(nèi)隨著KLa的增加，生物量和代謝產(chǎn)物也呈線性增加；

溶氧濃度：在不同氧濃度下對(duì)毛地黃細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基氧濃度從10%飽和度上升至30%時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率從0.15d-1上升至0.20d-1，如果溶氧濃度繼續(xù)上升至40%飽和度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率反而下降至0.17d-1。第六十三頁，共八十二頁，2022年，8月28日

植物細(xì)胞能非光合地利用CO2，如在通氣調(diào)節(jié)過程中，混入2%～4%的CO2即能消除高通氣速率對(duì)長(zhǎng)春花細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的不利影響。第六十四頁，共八十二頁，2022年，8月28日

植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中易產(chǎn)生大量的泡沫，且覆蓋有蛋白質(zhì)和粘多糖，細(xì)胞極易被包埋在其中從循環(huán)的培養(yǎng)液中帶出來，形成非均相培養(yǎng)，從而影響培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)率。第六十五頁，共八十二頁，2022年，8月28日化學(xué)消泡劑：----具有一定的表面張力和一定的親水性，以使消泡劑對(duì)氣/液界面的分散系數(shù)足夠大，消泡作用迅速有效；----化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在水中的溶解度小，不與次生產(chǎn)物起任何化學(xué)反應(yīng)對(duì)植物細(xì)胞無毒害；----不影響氣體在營(yíng)養(yǎng)液中的傳遞和溶解；----來源方便，價(jià)格便宜；----常用的化學(xué)消泡劑包括天然油脂質(zhì)、高級(jí)醇類、聚醚類和硅酮類，實(shí)際應(yīng)用中必須根據(jù)所培養(yǎng)的植物種類、次生產(chǎn)物特性等具體選擇。第六十六頁，共八十二頁，2022年，8月28日機(jī)械消泡是靠機(jī)械裝置實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)點(diǎn)是勿需在培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)，從而減少了由于消泡劑所引起的污染和對(duì)后續(xù)分離工藝的影響。但效果不如化學(xué)消泡迅速徹底同時(shí)也會(huì)增加培養(yǎng)裝置的復(fù)雜性。第六十七頁，共八十二頁，2022年，8月28日四培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝及產(chǎn)物積累植物次生代謝及其產(chǎn)物類型提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑

培養(yǎng)下的植物細(xì)胞次生產(chǎn)物積累特性第六十八頁，共八十二頁，2022年，8月28日

合成生命活動(dòng)必需物質(zhì)的代謝過程稱為初生代謝(primarymetabolism)

，這是一類普遍存在于生物中的代謝類型，與生物生存有關(guān)的、涉及到能量產(chǎn)生和消耗的代謝類型。所生成的物質(zhì)有糖類、脂類、核酸和蛋白質(zhì)等，這些產(chǎn)物稱為初生代謝產(chǎn)物(primarymetabolites)。（一）植物次生代謝及其產(chǎn)物類型

利用某些初生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的一類與植物生命活動(dòng)無直接關(guān)系的小分子化合物如甙類、生物堿類、萜類、內(nèi)酯類、酚類化合物等，它們稱為次生代謝產(chǎn)物(secondarymetabolites)把這個(gè)代謝過程稱次生代謝(secondarymetabolism)。第六十九頁，共八十二頁，2022年，8月28日1、酚類化合物—包括黃酮類、醌類和簡(jiǎn)單酚類

許多黃酮類化合物是治療心血管疾病和高血壓的藥物成分，異黃酮類往往是植物抗毒素；

醌類化合物按環(huán)系統(tǒng)不同可以分為苯醌、萘醌及蒽醌。醌是植物呈現(xiàn)顏色的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，有些醌類化合物具有抗菌、抗癌作用；

簡(jiǎn)單酚類廣泛分布于植物的葉片及其他組織中，對(duì)植物發(fā)育有一定的調(diào)節(jié)作用，有些酚類化合物是植物抗毒素的重要成分第七十頁，共八十二頁，2022年，8月28日2、萜類化合物

萜類化合物是由異戊二烯單元組成的化合物，在植物體內(nèi)通過異戊二烯途徑合成，廣泛分布于各類植物中，已知萜類化合物已超過2萬種；

根據(jù)異戊二烯單元數(shù)目及其結(jié)構(gòu)的不同可分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜以及甾類化合物；

單萜和倍半萜是植物揮發(fā)油和香料的主要成分。有的具有重要藥用價(jià)值如目前抗瘧疾最佳藥物青蒿素是一種倍半萜，抗癌藥物紫杉醇則是二萜生物堿。植物體內(nèi)三萜皂甙元和甾體皂甙元分別與糖類結(jié)合可形成三萜皂甙和甾體皂甙，如人參皂甙和薯蕷皂甙等。第七十一頁，共八十二頁，2022年，8月28日3、含氮化合物

含氮化合物主要包括生物堿、胺類、非蛋白質(zhì)氨基酸和生氰苷。其中生物堿是一類含氮的堿性天然產(chǎn)物，已知的生物堿已達(dá)5500種以上，多分布于雙子葉植物中。許多生物堿是藥用有效成分，有些是植物抗毒素。目前對(duì)生物合成途徑研究比較清楚的有煙草的煙堿、毒藜?jí)A和吡咯啶生物堿，毛莨科植物的小檗堿，以及曼陀羅植物的莨菪堿和東莨菪堿。第七十二頁，共八十二頁，2022年，8月28日（二）培養(yǎng)條件下的植物細(xì)胞次生產(chǎn)物積累的特性

生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)成正比。如長(zhǎng)春花屬植物中長(zhǎng)春花堿的合成、煙草細(xì)胞的煙堿合成，及薯蕷屬植物中的薯蕷皂甙的合成等；中間型產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長(zhǎng)下降時(shí)合成，細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期或停止生長(zhǎng)產(chǎn)物都不合成。蒽醌類物質(zhì)合成的植物細(xì)胞，托品類生物堿類合成的植物細(xì)胞等屬于此類型；

非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)停止以后。紫草寧的合成屬此類。第七十三頁，共八十二頁，2022年，8月28日（三）提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑1、選擇適宜的起始材料－－包括適宜的植物種類和取材部位

東北紅豆杉幼嫩莖、葉片及芽三種外植體形成的愈傷組織中，紫杉醇含量比較顯示，以葉片為外植體的愈傷組織，其紫杉醇含量是其它兩種外植體形成的愈傷組織的3倍。在茜草愈傷組織培養(yǎng)中，來源于葉柄和莖的愈傷組織其蒽醌的積累量比來源于莖尖和葉的愈傷組織高。第七十四頁，共八十二頁，2022年，8月28日2、選擇適宜的培養(yǎng)基

一般說來，增加培養(yǎng)基的N、P和K濃度能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而適當(dāng)增加糖濃度有利于次生產(chǎn)物的合成。如葡萄細(xì)胞培養(yǎng)中顯示，低氮、高蔗糖濃度有利于酚類化合物積累。

培養(yǎng)基硝態(tài)氮和氨態(tài)氮的比例對(duì)茶愈傷組織和兒茶素積累有明顯影響，當(dāng)NO3-/NH4+的比值在7：3時(shí)，有利于愈傷組織生長(zhǎng)，但對(duì)于兒茶素的積累，則以全硝態(tài)氮為宜。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)次生代謝產(chǎn)物的影響隨次生產(chǎn)物種類不同而有很大變化。東北紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基添加一定濃度2，4-D可顯著提高細(xì)胞生長(zhǎng)速率，添加適當(dāng)濃度BA和KA則可提高紫杉醇的積累。第七十五頁，共八十二頁，2022年，8月28日3、前體(precu