基因芯片在魚類病毒檢測(cè)中的應(yīng)用,病毒學(xué)論文

基因芯片在魚類病毒檢測(cè)中的應(yīng)用,病毒學(xué)論文建立對(duì)多種病毒的快速、高通量、低成本的分子檢測(cè)方式方法，對(duì)保障養(yǎng)殖魚類健康、防止疾病發(fā)生具有重要的意義。淋巴囊腫病毒〔lymphocystisdiseasevirus,LCDV〕、大菱鲆紅體病虹彩病毒〔turbotreddishbodyiridovirus,TRBIV〕、細(xì)胞腫大病毒屬虹彩病毒〔Megalocytivirus,Mega〕、赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒〔red-spottedgrouperner-vousnecrosisvirus,RGNNV〕、傳染性造血器官壞死病毒〔infectioushaematopoieticnecrosisvirus,IHNV〕、傳染性胰臟壞死病毒〔infectiouspancre-aticnecrosisvirus,IPNV〕、病毒性出血敗血癥病毒〔viralhemorrhagicsepticemiavirus,VHSV〕、傳染性鮭魚貧血病毒〔infectioussalmonanaemiavi-rus,ISAV〕是養(yǎng)殖魚類主要的病毒性病原，均能引起傳染性、爆發(fā)性疾病。國(guó)內(nèi)外關(guān)于這些病毒的毒力基因分析以及分子檢測(cè)已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道。華而不實(shí)LCDV、TRBIV、Mega和RGNNV都含有衣殼蛋白〔CP〕，在病毒顆粒中負(fù)責(zé)包被病毒核酸和核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體，由于不同病毒的CP基因序列類似性較低，因而該基因可用于這些病毒的特異性鑒定[1-3].核蛋白基因〔N〕是IHNV的主要毒力基因之一，通常被用于IHNV的分子鑒定以及其毒性強(qiáng)弱的判定[4].VP5是IPNV的主要毒力基因之一，因而VP5基因可作為檢測(cè)IPNV的生物學(xué)標(biāo)記[5].糖蛋白基因〔G〕是VHSV的主要毒力基因之一，常被用于VHSV的分子鑒定以及其毒性強(qiáng)弱的判定[6].核蛋白NS、基質(zhì)蛋白MA是ISAV的主要毒力基因，因而NS、MA基因可作為檢測(cè)ISAV的生物學(xué)標(biāo)記[7].基因芯片作為生物芯片的一種，最初是在20世紀(jì)80年代初由BainsW.等人提出的概念。當(dāng)前是在生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的最為廣泛也最為成熟的一種對(duì)大量的遺傳信息進(jìn)行高效、快速的檢測(cè)和分析的方式方法。在表示出譜的構(gòu)建[8]、挑選相關(guān)基因[9]、臨床診斷上都有廣泛的研究和應(yīng)用[10].基因芯片在臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)上的應(yīng)用已有相關(guān)的報(bào)道，但在魚類病毒的檢測(cè)方面研究很少。本研究針對(duì)上述魚類病毒，建立了基因芯片檢測(cè)方式方法，對(duì)其反響參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化并進(jìn)行了初步應(yīng)用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料與方式方法1.1材料1.1.1含病毒基因的克隆質(zhì)粒。含有LCDV、TRBIV、Mega、RGNNV、IHNV、IPNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA相關(guān)基因的T-A克隆質(zhì)粒和菌株均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，用作基因芯片檢測(cè)的陽(yáng)性模板〔各基因的GenBank檢索號(hào)見表1〕。1.1.2主要試劑、耗材。實(shí)驗(yàn)中所用到的Trans-StartTMTopTaqDNAPolymerase、HighPuredNTPs購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技〔北京〕有限公司，質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自博邁德生物，氨基、醛基修飾片基購(gòu)自博奧生物。1.2方式方法1.2.1病毒基因陽(yáng)性模板的制備。分別將含有LCDV、TRBIV、Mega、RGNNV、IHNV、IPNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA等病毒相關(guān)基因的克隆菌株過夜培養(yǎng)。對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀〔美國(guó)Nano-Drop2000〕測(cè)定核酸的濃度和純度，保存于-20?C備用。1.2.2基因芯片探針的設(shè)計(jì)。各病毒探針的設(shè)計(jì)方式方法是：根據(jù)病毒特異性的基因序列，使用Al-leleID7.0軟件設(shè)計(jì)寡核苷酸探針〔25~30mer〕，使其分別與病毒的CP、N、VP5、G、NS、MA等基因位點(diǎn)互補(bǔ)。除此之外，在各探針5端連上一段長(zhǎng)度為15mer的poly〔dT〕作為間隔臂，以減少探針與片基之間的空間位阻，提高其雜交效率〔檢測(cè)各魚類病毒的探針序列見表1〕。本研究還設(shè)計(jì)了基因芯片的3套質(zhì)控探針，即外表化學(xué)質(zhì)控探針、陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針。外表化學(xué)質(zhì)控探針〔QC-1〕：隨機(jī)寫出一段寡核苷酸序列〔5-ACAAGGGATATCGCTGGGT-3〕，該序列不產(chǎn)生穩(wěn)定的二級(jí)構(gòu)造，與病原基因序列也沒有同源性。陽(yáng)性對(duì)照探針〔QC-2〕：根據(jù)牛的-珠蛋白基因〔HBB〕設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和陽(yáng)性對(duì)照探針，擴(kuò)增得到的標(biāo)記產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照探針雜交產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。陰性對(duì)照探針〔QC-3〕：根據(jù)牛的-珠蛋白基因〔HBB〕進(jìn)行陰性探針的設(shè)計(jì)。另外設(shè)置一套空白對(duì)照〔QC-4〕，即以ddH2O代替探針點(diǎn)樣。1.2.3基因芯片和Cy3標(biāo)記產(chǎn)物的制備。芯片制備：將各探針以50%DMSO稀釋至20mol/L,操作PersonalArrayer16個(gè)人點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于醛基修飾玻片，每種探針并排點(diǎn)3份，即設(shè)置3個(gè)平行。將玻片置于濕盒中室溫放置4h,0.5%SDS清洗10min,超純水洗滌2min,離心后4℃保存。采用多重PCR技術(shù)對(duì)魚類病毒的相關(guān)基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行同步Cy3標(biāo)記。1.2.4雜交體系組成。雜交體系總體積15L:含100%甲酰胺3.75L,20SSC2.25L,10%SDS0.3L,50Denhardts1.5L,Cy3標(biāo)記產(chǎn)物7.2L.1.2.5氨基片基和醛基片基比照。氨基片基探針的固定：將未修飾的LCDV、RGNNV探針以50%DMSO稀釋至20mol/L,點(diǎn)樣后將玻片置于80?C烘箱80min,浸入超純水中1min,再迅速浸入-20?C無(wú)水乙醇中1min,超純水清洗2min,離心后4?C保存。醛基片基探針的固定：將5端帶有氨基修飾的LCDV、RGNNV探針按1.2.3制備流程進(jìn)行探針的固定。最后取LCDV、RGNNV的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物按1.2.4配制成雜交液與基因芯片進(jìn)行雜交、清洗和掃描，分析結(jié)果。1.2.6不同探針點(diǎn)樣液的比照。取LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV氨基修飾的探針，分別用50%DMSO、3SSC和ddH2O稀釋至20mol/L,進(jìn)行醛基片基點(diǎn)樣。取等量LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物，按1.2.4配制雜交液，進(jìn)行雜交、清洗，最后用LuxScan10K掃描儀掃描，分析結(jié)果。1.2.7芯片雜交探針濃度的優(yōu)化。取LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的氨基修飾探針以50%DMSO分別稀釋成20、15、10、5mol/L,進(jìn)行醛基片基點(diǎn)樣。取等量LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物，按1.2.4配制雜交液，進(jìn)行雜交、清洗和掃描，分析結(jié)果。1.2.8芯片雜交溫度的優(yōu)化。取LCDV、RGN-NV、IHNV、IPNV的氨基修飾探針點(diǎn)樣，取等量LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物，按1.2.4配制交體系，每次取一張基因芯片進(jìn)行雜交，每次的雜交溫度分別設(shè)定為37?C、42?C、47?C、52?C、57?C,最終清洗、掃描，分析結(jié)果。1.2.9芯片雜交時(shí)間的優(yōu)化。取LCDV、RGN-NV、IHNV、IPNV的氨基修飾探針點(diǎn)樣，取等量LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物，按1.2.4配制雜交體系，取四張芯片進(jìn)行雜交，雜交經(jīng)過中每隔0.5h取出一張芯片進(jìn)行清洗，最終進(jìn)行芯片的掃描，分析結(jié)果。1.2.10優(yōu)化后芯片的整體雜交效果。根據(jù)上述優(yōu)化得到的最佳反響參數(shù)，對(duì)LCDV、TRBIV、Mega、RGNNV、IHNV、IPNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA進(jìn)行Cy3標(biāo)記產(chǎn)物的制備、與芯片進(jìn)行雜交、清洗和掃描，評(píng)價(jià)雜交效果。1.2.11基因芯片對(duì)病魚樣品的檢測(cè)。取患病魚的腦、脾、腎等組織，分別提取DNA和RNA.對(duì)DNA和反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，制備Cy3標(biāo)記產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)1.2.10所述進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，分析檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)使用常規(guī)PCR方式方法進(jìn)行病毒檢測(cè)，作為比照。2結(jié)果與分析2.1氨基片基與醛基片基的雜交效果比照醛基片基的點(diǎn)樣結(jié)果與氨基片基相比，點(diǎn)陣愈加均一，雜交信號(hào)強(qiáng)度明顯高于氨基片基〔圖1〕。表示清楚醛基片基的探針結(jié)合能力更強(qiáng)，因而本研究選用醛基片基進(jìn)行基因芯片的制備。2.2不同點(diǎn)樣液的比照通過對(duì)不同點(diǎn)樣液制備的芯片進(jìn)行雜交、清洗及掃描，結(jié)果顯示：50%DMSO效果最好，該點(diǎn)樣液的點(diǎn)圓潤(rùn)均一，雜交信號(hào)最強(qiáng)；而3SSC作為點(diǎn)樣液雜交信號(hào)強(qiáng)度較弱，且部分點(diǎn)出現(xiàn)擴(kuò)散、大小不均一的情況；ddH2O作為點(diǎn)樣液的雜交結(jié)果幾乎看不到信號(hào)〔圖2〕。因而選用50%DMSO作為基因芯片制備的點(diǎn)樣液。2.3芯片雜交探針濃度的優(yōu)化通過對(duì)不同濃度探針制備的芯片進(jìn)行雜交、清洗及掃描，結(jié)果顯示：隨著探針濃度的逐步降低，雜交信號(hào)強(qiáng)度與雜交信號(hào)均值大致呈下降趨勢(shì)。由于各探針的點(diǎn)樣均一程度等問題，個(gè)別雜交點(diǎn)出現(xiàn)了低濃度探針雜交信號(hào)高于高濃度探針雜交信號(hào)的情況〔圖3〕。綜合比擬，探針終濃度為20mol/L時(shí)雜交效果最好，因而選用該濃度的探針用于基因芯片的檢測(cè)。2.4雜交溫度的優(yōu)化當(dāng)雜交溫度為37?C、42?C、47?C時(shí)，樣品的熒光信號(hào)均清楚明晰可見。隨著溫度的升高，信號(hào)強(qiáng)度也相應(yīng)加強(qiáng)，在47?C時(shí)到達(dá)最強(qiáng)。當(dāng)雜交溫度升高至52?C時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度急劇下降。華而不實(shí)LCDV和RGNNV的信號(hào)強(qiáng)度很弱；當(dāng)雜交溫度升高至57?C時(shí)，IHNV和IPNV的信號(hào)強(qiáng)度也變得很弱〔圖4〕。因而最終選擇47?C作為基因芯片的最佳雜交溫度。2.5雜交時(shí)間的優(yōu)化當(dāng)雜交時(shí)間為0.5h時(shí)，幾乎看不到樣品的熒光信號(hào)；雜交1.0h后，熒光信號(hào)有所加強(qiáng)。隨著雜交時(shí)間延長(zhǎng)至1.5h時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也到達(dá)了峰值。繼續(xù)延長(zhǎng)雜交時(shí)間至2.0h時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度并無(wú)明顯增加〔圖5〕。綜合考慮，選用1.5h作為基因芯片的最佳雜交時(shí)間。2.6參數(shù)優(yōu)化后的基因芯片雜交效果制備魚類病毒相關(guān)基因Cy3標(biāo)記產(chǎn)物之后，應(yīng)用上述優(yōu)化后的反響參數(shù)，進(jìn)行基因芯片的雜交。結(jié)果顯示：病毒探針均能與對(duì)應(yīng)的Cy3標(biāo)記產(chǎn)物雜交，并產(chǎn)生均勻的熒光信號(hào)，整體雜交效果非常理想〔圖6〕。2.7對(duì)病魚樣品的檢測(cè)結(jié)果在對(duì)病魚樣品的實(shí)際檢測(cè)中，該基因芯片對(duì)本實(shí)驗(yàn)室收集到的19份樣品的檢測(cè)結(jié)果為：養(yǎng)成期牙鲆中檢出LCDV的感染，養(yǎng)成期大菱鲆中檢出TRBIV的感染，在半滑舌鰨魚苗中檢出RGNNV的感染，在石斑魚中檢出細(xì)胞腫大屬〔Mega〕病毒〔圖7〕。該檢測(cè)結(jié)果與使用常規(guī)PCR的檢測(cè)結(jié)果完全一致。3討論在魚類的養(yǎng)殖經(jīng)過中，多種病毒病的發(fā)生往往會(huì)帶來(lái)宏大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展，因而研發(fā)快速、可靠、高通量的病毒檢測(cè)方式方法具有重要價(jià)值。生物芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在基因工程和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[9,11],在水產(chǎn)方面的研究和應(yīng)用也日益增加，比方在水母分型及進(jìn)化地位[12]、貝類致病性弧菌[13]、對(duì)蝦致病菌[14]、魚類病原菌[15-16]等方面，但在魚類病毒方面的研究和應(yīng)用卻很少。本研究建立了基因芯片技術(shù)檢測(cè)魚類病毒的方式方法，優(yōu)化了反響參數(shù)，得到了穩(wěn)定、清楚明晰的雜交結(jié)果，并在魚類病毒檢測(cè)中的進(jìn)行了初步應(yīng)用。本研究建立的基因芯片檢測(cè)技術(shù)能夠在一個(gè)微陣列中與7種病毒10個(gè)基因的標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行雜交，并得到理想的雜交效果，這在很大程度上提高了重要海水養(yǎng)殖魚類病原篩查工作的效率，與已報(bào)道的僅能同時(shí)檢測(cè)2種魚類病毒的基因芯片相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)[17].在探針設(shè)計(jì)方面，本研究在每條探針的5端連上一段長(zhǎng)度為15mer的poly〔dT〕作為間隔臂，進(jìn)而有效地降低了探針與片基間的空間位阻，提高了標(biāo)記產(chǎn)物與其雜交的效率?？傊狙芯拷⒌幕蛐酒瑱z測(cè)魚類病毒的方式方法，具有通量高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，為魚類的多病原檢測(cè)及流行病調(diào)查提供了快速、有效的工具，對(duì)保障養(yǎng)殖魚類健康、防治疾病發(fā)生具有重要的意義。本研究的缺乏之處是對(duì)建立并優(yōu)化的基因芯片方式方法應(yīng)用缺乏，今后需要使用更多的樣品對(duì)該基因芯片進(jìn)行驗(yàn)證和測(cè)試，以便持續(xù)改良。以下為參考文獻(xiàn)：[1]閆秀英，吳灶和，簡(jiǎn)紀(jì)常，等。淋巴囊腫病毒中國(guó)分離株基因組序列和構(gòu)造分析[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2018,31〔1〕：1-6.[2]吳成龍，史成銀，黃倢，等。大菱鲆紅體病虹彩病毒主要衣殼蛋白基因在畢赤酵母中的重組分泌表示出[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，200〔93〕：55-61.[3]ChoiYR,KimHJ,LeeJY,etal.C