引物設(shè)計流程

實(shí)時熒光定量PCR引物設(shè)計及相關(guān)軟件運(yùn)用主要內(nèi)容1.背景2.引物設(shè)計原則3.常用引物設(shè)計軟件4.PrimerPremier5和Oligo6介紹5.引物BLAST一、背景■實(shí)時熒光定量PCR是通過實(shí)時監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法，它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)并通過real-timePCR檢測系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，最終對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理的方法。■引物是該技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。運(yùn)用不合適的引物簡潔導(dǎo)致試驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的條帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱等。引物可以通過參考文獻(xiàn)獲得，也可以進(jìn)行自己設(shè)計，無論哪種方式引物都是要通過計算機(jī)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)。→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer引物的設(shè)計原則可以依據(jù)實(shí)際需求自己靈敏把握。二、引物設(shè)計原則三、常用的引物設(shè)計軟件PrimerPremier5（自動搜尋）*Oligo6（引物評價）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務(wù)）四、PrimerPremier5和Oligo6介紹■PrimerPremier5主要功能：1、引物自動搜尋和設(shè)計2、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析Oligo6主要功能：引物設(shè)計與分析PrimerPremier5在引物搜尋上較Oligo6有優(yōu)勢，并可以對引物序列進(jìn)行綜合評分。Oligo6在引物結(jié)構(gòu)分析上有比PrimerPremier5強(qiáng)大的功能。所以，設(shè)計引物的時候我們可以將兩個軟件結(jié)合起來?！鯬rimerPremier5和Oligo6比較■軟件運(yùn)用前的準(zhǔn)備工作1、下載并安裝PrimerPremier5和Oligo6。2.進(jìn)入NCBI的基因庫查找所需的基因序列。序列的查找方法CDS是編碼序列，所以一般選擇此序列作為設(shè)計的基因源序列給出的基因序列為全序列，設(shè)計引物只要CDS中的序列PrimerPremier5引物搜尋PreimerPremier啟動界面選擇序列基本信息序列名稱源序列只能用ctrl+v才能輸入目的序列輸入序列引物設(shè)計界面上游和下游鏈引物信息欄引物搜尋選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜尋模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度搜尋結(jié)果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer保存引物信息保存時要安裝一個虛擬打印機(jī)一對志向的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的狀況是最下面的分析欄都沒有出現(xiàn)紅色，而且評分較高，Tm值55-60℃之間。但是往往有時候達(dá)不到那么嚴(yán)格的要求，因此我們可以適當(dāng)放寬要求，但是二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)是不能有的，Tm值也不能相差超過2℃。Oligo6引物結(jié)構(gòu)分析打開新序列ctrl+v輸入序列3個彈出窗口Meltingtemperature?GInternalStabilityFrq為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。用Oligo人工設(shè)計引物時的3個特點(diǎn)Tm值曲線以選取5’到3’的下降形態(tài)有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線宜選用3’端Frq值相對較低的片段。ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低輸入引物選中引物上游引物下游引物引物結(jié)構(gòu)分析引物關(guān)鍵信息發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物二聚體GC含量PCR總信息錯配信息引物篩結(jié)構(gòu)分析條件

1.KeyInformation：3，端得△G≤9kcal/mol。Tm盡量一樣，最好限制在55℃～60℃。

2.DuplexFormation：≤3base，△G≤4.5kcal/mol。

3.HairpinFormation：≤3base，△G≤4.5kcal/mol。

4.GC%：GC含量在40～60%之間，兩條引物最好保持一樣。

5.Falseprimingsites：要使錯誤引發(fā)效率在100以下，當(dāng)然有時候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話，比如達(dá)到400～500，錯誤引發(fā)效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。最終PCR信息五、引物BLAST推斷一個引物是否合適最重要的一步就是比對，假如你所設(shè)計的的引物通過比對不能返回到你設(shè)計引物的源基因，那么你的引物就是不合格的，即使你設(shè)計出來的引物其余的條件都符合，必需放棄。1.進(jìn)入BLAST界面2、輸入引物對引物對要從5，端到3，端輸入，上游引物和下游間輸入20以上n比對條件設(shè)置3、比對結(jié)果圖中①代表這些序列與引物匹配的得分值小于40分圖中②代表這些序列與引物匹配的得分值位于40～50分圖中③代表這些序列與引物匹配的得分值位于80～120分，分值越高，特異性越好。線段代表上或下游引物，其顏色和上面比照后就可得出