微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)12 微生物數(shù)量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)十二微生物數(shù)量的測(cè)定微生物的生長(zhǎng)通常以群體的生長(zhǎng)作為指標(biāo)。群體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或者細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定微生物數(shù)量的主要方法：顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（不辨死活）P51光電比濁法（不用于顏色太深的樣品）P86平板菌落計(jì)數(shù)法（形成菌落的微生物）P32測(cè)定細(xì)胞重量法（測(cè)定絲狀真菌生長(zhǎng)量）測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量（適于濃度較高的樣品）。。。。。。

目的要求了解血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、計(jì)數(shù)原理和計(jì)數(shù)方法；掌握顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的技能。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種方法。直接計(jì)數(shù)法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速、操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)。常用計(jì)菌器常用計(jì)數(shù)器有血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Petroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等。各種計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理相同，只是血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡觀察，只能計(jì)數(shù)較大的霉菌孢子和酵母菌；而后兩種計(jì)菌器，可以使用油鏡觀察，因此可以直接計(jì)數(shù)細(xì)菌。

血球計(jì)數(shù)板Petroff-Hauser計(jì)菌器Hawksley計(jì)菌器血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)。每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格。無(wú)論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬(wàn)分之一毫升)。計(jì)數(shù)方法計(jì)算：1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*25*104*B=50000*A*B1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*16*104*B=32000*A*B其中B為稀釋倍數(shù)。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)5個(gè)中方格的總菌數(shù)A，然后求每個(gè)中方格的平均值，再乘上大方格（計(jì)數(shù)室）中方格的數(shù)量(25或16)，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，再換算成每毫升菌液中微生物細(xì)胞的數(shù)量。注意事項(xiàng)對(duì)于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。對(duì)于壓線酵母，按照數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)器材活材料：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培養(yǎng)液。其他器材：顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、電吹風(fēng)、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計(jì)數(shù)器、滴管、擦鏡紙。實(shí)驗(yàn)方法

1、用無(wú)菌生理鹽水將待測(cè)菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液（以每個(gè)小方格中5～10個(gè)菌為宜）。2、取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊（事先鏡檢），蓋上一塊蓋玻片。3、將菌懸液搖勻，用無(wú)菌吸頭吸取少許，沿蓋玻片邊緣滴加，讓菌懸液利用毛細(xì)滲透作用充滿計(jì)數(shù)區(qū)。4、加樣后靜止5min，將計(jì)數(shù)板置顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)區(qū)，然后換高倍鏡計(jì)數(shù)。（光不宜太強(qiáng)，需要使用濾光片）5、計(jì)數(shù)完畢，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，用電吹風(fēng)吹干，鏡檢確認(rèn)計(jì)數(shù)區(qū)無(wú)殘留菌體或其它沉淀。6.作業(yè)：結(jié)果（填表）P55清洗時(shí)切勿用刷子等硬物，也不可用酒精燈火焰烘烤取樣時(shí)要搖勻菌液，加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生清洗時(shí)切勿用刷子等硬物，也不可用酒精燈火焰烘烤了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理。學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計(jì)數(shù)法的操作方法。目的要求光電比濁計(jì)數(shù)法基本原理當(dāng)光線通過(guò)微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過(guò)量降低。在一定范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比，與吸光度成正比，而吸光度或透光度可以精確測(cè)出。因此，可用一系列已知細(xì)菌數(shù)量的菌懸液測(cè)定吸光度，作出吸光度-菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，以待測(cè)樣品液所測(cè)得的吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)。光電比濁計(jì)數(shù)法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速，可用于多個(gè)樣品同時(shí)測(cè)定測(cè)定。缺點(diǎn)：吸光度受細(xì)胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及選用的波長(zhǎng)的影響；對(duì)于不同微生物的菌懸液要選擇相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)于顏色太深的樣品或產(chǎn)生具有吸光特性物質(zhì)的細(xì)菌不能用此法。器材菌種釀酒酵母培養(yǎng)液儀器或其他用具分光光度計(jì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無(wú)菌吸頭，無(wú)菌生理鹽水等。操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作測(cè)定樣品吸光度每毫升細(xì)胞數(shù)光密度值標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)：首先直接計(jì)數(shù)釀酒酵母菌懸液原液細(xì)胞數(shù)。（2×108菌/mL）2、稀釋菌液：將上述已知濃度的釀酒酵母菌懸液用無(wú)菌生理鹽水分別稀釋成為（依次2倍稀釋）：1×108、5×107、2.5×107、1.25×107、6.25×106、3.125×106菌/mL的菌懸液。3、測(cè)OD值：以無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照，于波長(zhǎng)560nm處用1cm比色皿測(cè)定上述各菌液的OD值。4、以每毫升菌數(shù)為橫坐標(biāo)，所測(cè)OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。操作步驟振蕩混勻原液3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml2-12-22-32-42-5+待測(cè)樣品的測(cè)定1、稀釋：將待測(cè)菌懸液用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋。2、測(cè)定：在560nm波長(zhǎng)測(cè)定稀釋后菌懸液的吸光度。3、計(jì)算：根據(jù)所測(cè)得的吸光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的含菌數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)就得到原液中細(xì)菌數(shù)。4、作業(yè)：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將比濁法所測(cè)結(jié)果同直接計(jì)數(shù)結(jié)果作比較。722型分光光度計(jì)操作方法開(kāi)機(jī)預(yù)熱：接通電源，打開(kāi)儀器開(kāi)關(guān)，掀開(kāi)樣品室暗箱蓋，預(yù)熱10至15分鐘。選擇波長(zhǎng)：將靈敏度開(kāi)關(guān)調(diào)至“1”檔（若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時(shí)，需選用較高檔）。選擇合適的波長(zhǎng)。調(diào)零：將空白液倒入比色皿中（不少于3/4），用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，光面對(duì)準(zhǔn)光路。將吸光度設(shè)置為0％，確認(rèn)；將透光度設(shè)置為100％，確認(rèn)。測(cè)定：將樣品加入另一個(gè)比色皿，放入樣品室，讀取吸光度。關(guān)機(jī)：測(cè)定完畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。

平板菌落計(jì)數(shù)法掌握平板菌落計(jì)數(shù)的的原理和方法目的要求基本原理將待測(cè)菌液經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋，涂布在平皿上，經(jīng)培養(yǎng)后可以長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落；統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計(jì)算出樣品中細(xì)胞的濃度。該方法能直接反應(yīng)樣品中活細(xì)胞的數(shù)量，可用于生物制品、食品、水質(zhì)等檢測(cè)。每毫升樣品中菌落形成單位數(shù)（CFU）=每皿菌落平均數(shù)×1/取樣體積數(shù)×稀釋倍數(shù)操作步驟稱取10g土樣振蕩10min90ml9ml9ml9ml9ml9ml0.1ml0.1ml0.1ml1ml1ml1ml1ml1ml10-110-210-310-410-510-6倒培養(yǎng)基2×制備土壤稀釋液→涂平皿→培養(yǎng)→計(jì)數(shù)每毫升樣品中菌落形成單位數(shù)（CFU）=每皿菌落平