儀器分析 第20章毛細(xì)管電泳法

第20章毛細(xì)管電泳法28-2電介質(zhì)中帶電粒子在電場(chǎng)作用下向電荷相反方向遷移的現(xiàn)象稱為電泳electrophoresis。利用電泳現(xiàn)象進(jìn)行分離分析的方法稱為電泳法。1930年，Tiselius電泳分離血清蛋白，獲1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。20世紀(jì)60年代后，出現(xiàn)管狀電泳；1981年，Jorgenson和Lukacs使用毛細(xì)管分離丹酰化氨基酸獲得高柱效，并理論證明CE柱效正比于電場(chǎng)強(qiáng)度、反比于分子擴(kuò)散系數(shù)；1988年，CE商品化；近年來(lái)，出現(xiàn)CCE（芯片式）、CAE（陣列式）等28-3一、電滲和電滲率二、電泳和電泳淌度三、表觀淌度四、分離效率和譜帶展寬五、分離度20.1CE的基礎(chǔ)理論28-4當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲。電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流，EOF1、電滲流現(xiàn)象

當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。一、電滲和電滲率28-52、CE中的電滲現(xiàn)象與電滲流石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH>3時(shí)，表面電離成-SiO－,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度ν電滲流。28-63、CE中電滲流的大小電滲流的大小用電滲流速度uos表示，取決于電滲率或電滲淌度μos和電場(chǎng)強(qiáng)度E，即uos=μosE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢(shì)，即

μ=εξos／4πηε介電常數(shù)；ζos毛細(xì)管壁的Zeta電勢(shì);η黏度28-74、CE中電滲流的方向電滲流的方向取決于：毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極；石英毛細(xì)管：帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：（1）毛細(xì)管改性：表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)；（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑：內(nèi)充液中加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽(yáng)極。28-85、CE中電滲流的作用各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：u＋＝uos＋ueff

陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；u－＝uos－ueff陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反；u0＝uos

中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍，因此：任何粒子均隨電滲流朝一個(gè)方向移動(dòng)作用：在CE中，控制電滲流非常重要可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離；改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性；電滲流的微小變化會(huì)直接影響結(jié)果的重現(xiàn)性；28-96、CE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流的流動(dòng)為平流，塞式流動(dòng)（譜帶展寬很小）；液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。28-107、CE中影響電滲流的因素電場(chǎng)強(qiáng)度的影響

電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。毛細(xì)管材料的影響

不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；28-11電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響溶液pH的影響對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢(shì)增大，電滲流增大，pH=7，達(dá)到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采用緩沖溶液來(lái)保持pH穩(wěn)定。陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時(shí)，毛細(xì)管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強(qiáng)度影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。28-1228-13溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度每變化1℃，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%；溫度變化來(lái)自于焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過時(shí)，產(chǎn)生的熱量；CE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。

28-14添加劑的影響加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向。如加入不同陽(yáng)離子表面活性劑來(lái)控制電滲流。加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負(fù)電荷增加，zeta電勢(shì)增大，電滲流增大；加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。28-1528-16二、電泳和電泳淌度電泳是指在電場(chǎng)作用下帶電離子在緩沖溶液中定向移動(dòng)的現(xiàn)象。不同離子具有不同的遷移速度uep：電泳淌度μep：溶質(zhì)在給定的緩沖溶液中和單位電場(chǎng)強(qiáng)度下單位時(shí)間內(nèi)移動(dòng)的距離，即單位電場(chǎng)下的電泳速度，也稱電泳遷移率。單位為m2/(V·s)28-17對(duì)于空心電泳毛細(xì)管，一個(gè)粒子的電泳淌度近似等于：凈電荷摩爾質(zhì)量可見：離子表面電荷密度不同，則電泳速度不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。有效淌度μeff：考慮到離子活度系數(shù)、溶質(zhì)的離解程度的影響遷移速度uep：電場(chǎng)強(qiáng)度E、介質(zhì)特性、電離度、電荷數(shù)、大小和形狀等28-18三、表觀淌度表觀淌度uap：不考慮粒子相互作用的條件下，粒子在毛細(xì)管中的運(yùn)動(dòng)速度是電泳流和電滲流速度的矢量和。出峰次序：正離子、中性粒子、負(fù)離子。中性粒子均與電滲流速度相同，故不能相互分離.正離子μos

＋

μeffuos

＋ueff中性粒子μosuos負(fù)離子μos

－μeffuos

－

ueff28-19四、分離效率和譜帶展寬（一）理論板數(shù)和塔板高度tm為遷移時(shí)間：流出曲線最高點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)間。Ld為進(jìn)樣口到檢測(cè)器的距離1、2、28-20遷移時(shí)間tm計(jì)算公式：按照Giddings色譜柱效理論：若分子擴(kuò)散是造成區(qū)帶展寬的唯一因素，則3、CE分離柱效方程式：特別適合分離生物大分子28-21（二）影響譜帶變寬的因素縱向擴(kuò)散：擴(kuò)散系數(shù)、遷移時(shí)間自熱：重要因素緣由：焦耳熱通過管壁擴(kuò)散散熱在管內(nèi)形成拋物線型徑向溫度梯度，導(dǎo)致黏度梯度，引起遷移速度徑向不均，造成帶寬。滿足Edc1/3＜1500時(shí)則不嚴(yán)重。石英導(dǎo)熱性好；小內(nèi)經(jīng)d、大外徑利于散熱；冷卻降溫恒溫；降低緩沖液濃度吸附：原因——陰陽(yáng)離子作用、疏水作用?？朔锎蠓肿映Ｓ猛繉犹幚砻?xì)管柱28-22五、分離度遷移速度差遷移速度平均值表明R是下列因素的函數(shù)：①外加電壓V；②有效柱長(zhǎng)與總長(zhǎng)度之比；③電泳有效淌度差；④電滲淌度。28-2320.2CE的主要分離模式一、毛細(xì)管電泳的分類自由溶液與非自由溶液電泳型、色譜性、電泳/色譜型分離模式：P430表20-2二、毛細(xì)管區(qū)帶電泳：CZE背景——緩沖溶液分離——基于組分荷質(zhì)比差異操作條件——分離電壓、緩沖液及其pH、添加劑28-2420.2CE的主要分離模式三、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜：MEKC背景——膠束分離——電泳+色譜條件——膠束的親水性與疏水性，流動(dòng)相選擇（緩沖液種類、濃度、pH、離子強(qiáng)度、添加劑）四、毛細(xì)管凝膠電泳：CGE背景——凝膠或篩分介質(zhì)分離——凝膠分子篩操作條件——因受pH影響，選擇性小于CZE28-2520.2CE的主要分離模式五、毛細(xì)管點(diǎn)色譜：CEC背景——CZE中的空管填充色譜固定相