纖維素酶的研究概述

纖維素酶的研究概述摘要：由于纖維素酶對(duì)地球上廣泛存在的纖維素具有水解作用，已經(jīng)被應(yīng)用于越來(lái)越多的領(lǐng)域。纖維素酶是多酶體系，它由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖纖維二糖水解酶和0-葡萄糖苷酶三種組分組成，三種組分協(xié)同作用才能降解纖維素。不同菌種分泌的纖維素酶的三種組分比例不同，故其在發(fā)揮作用是的活性也有很大區(qū)別。因此，纖維素酶高產(chǎn)菌種的選育非常重要，主要手段有常規(guī)理化誘變、基因重組技術(shù)、基因定位突變技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)。其在工業(yè)上主要采用液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)。關(guān)鍵字：纖維素酶菌種選育液態(tài)發(fā)酵1纖維素酶簡(jiǎn)介纖維素酶是一種對(duì)纖維素大分子的水解具有特殊催化作用的活性蛋白質(zhì)，它是一組酶的總稱(chēng)，不是單成分酶，而是由多個(gè)酶起協(xié)同作用的多酶體系。其外觀為灰白色的無(wú)定形粉末或液體；最適作用溫度為40°C?55°C；反應(yīng)最適PH值為4.0?6.0；在40C?70C以下穩(wěn)定存在；溶于水，幾乎不溶于乙醇、乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑；該酶催化效率高，比一般酶高106~107倍。自1906年Seillere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶至今已有一百余年了，現(xiàn)在纖維素酶已被廣泛應(yīng)用于食品、釀酒、飼料加工、紡織、洗衣、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域5。食品方面，纖維素酶被應(yīng)用于果實(shí)和蔬菜加工、油料作物加工、茶葉加工、酒精生產(chǎn)、啤酒生產(chǎn)、食醋釀造、醬油釀造等生產(chǎn)工藝。在飼料工業(yè)中，纖維素酶用來(lái)制備低纖維飼料、飼料酶制劑、水解植物纖維生產(chǎn)飼料酵母。在紡織工業(yè)中，纖維素酶被用于纖維改性，真絲脫膠，染整的退漿、精煉、整理加工等方面。纖維素酶還被用于解決“白色污染”問(wèn)題。纖維素酶用于造紙工業(yè)，利用外切纖維素酶只從末端切斷纖維素的作用原理，可以提高紙張的光潔度⑵。纖維素酶在自然界分布極為廣泛，昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、高等植物、細(xì)菌、放線菌和真菌都能產(chǎn)生纖維素酶⑶。反芻動(dòng)物的瘤胃以及豬大腸也有分解纖維素的細(xì)菌存在。纖維素酶的來(lái)源主要有三方面：植物、動(dòng)物和微生物。纖維素酶雖然在植物中廣泛存在，且在植物發(fā)育的某些階段發(fā)揮著水解細(xì)胞壁的作用，如果實(shí)成熟、蒂柄脫落等，但從植物中提取纖維素酶比較困難，且含量不高。很多食木性的動(dòng)物及食草動(dòng)物之所以可以以植物為食物來(lái)源，主要是因?yàn)槠潴w內(nèi)存在內(nèi)源性的纖維素酶，但是依靠這類(lèi)動(dòng)物來(lái)進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)也比較困難。工業(yè)化纖維素酶的生產(chǎn)主要采用微生物來(lái)進(jìn)行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，20世紀(jì)60年代以來(lái)國(guó)內(nèi)外共記錄了產(chǎn)纖維素酶的菌株大約有53個(gè)屬的幾千個(gè)菌種。由于放線菌纖維素酶的產(chǎn)量極低，所以研究很少。細(xì)菌纖維素酶產(chǎn)量也不高，主要是葡聚糖內(nèi)切酶，大多數(shù)對(duì)結(jié)品纖維素沒(méi)有降解活性，且所產(chǎn)生的酶是胞內(nèi)酶或吸附在細(xì)胞壁上，不分泌到培養(yǎng)液中，增加了提取純化的難度，所以工業(yè)上很少采用細(xì)菌作為生產(chǎn)菌株囹。目前用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物較多的是絲狀真菌，其中酶活力較強(qiáng)的菌種為木霉、曲霉、根霉和青霉，以木霉屬菌種居多，較為典型的有里氏木霉、綠色木霉、康氏、木霉。2纖維素酶的組成與功能1933年Grassman從一種真菌產(chǎn)生的纖維素酶系中分辨出兩個(gè)組分。1950年，Resse等提出了著名的“C「Cx”假說(shuō)⑸來(lái)闡述纖維素酶的作用方式，該假說(shuō)的主要觀點(diǎn)為：纖維素酶是一個(gè)三組分的混合物，分別命名為C1酶、Cx酶和&-葡萄糖苷酶。它們對(duì)纖維素的作用方式不同，C1酶作用于纖維素的結(jié)品區(qū)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀籆x酶作用的形式；Cx酶隨機(jī)水解非結(jié)品纖維素、可溶性纖維素衍生物和葡萄糖的&-1，4-寡聚物；&-葡萄糖苷酶將纖維二糖和纖維三糖水解成葡萄糖。在水解天然纖維素（高結(jié)品纖維素）時(shí)，C1酶和Cx酶是分階段協(xié)調(diào)作用的，將已轉(zhuǎn)化成無(wú)定形纖維素的部分水解為水溶性產(chǎn)物?！癈1-Cx”假說(shuō)的提出引起了各國(guó)科學(xué)家對(duì)纖維素酶基礎(chǔ)研究的極大興趣。上世紀(jì)六十年代以來(lái)由于分子篩和離子交換樹(shù)脂等技術(shù)的應(yīng)用，纖維素酶的多組分性質(zhì)得到了證實(shí)。但是，Resse等提出的C1酶和Cx酶分階段水解纖維素的設(shè)想，即q、Cx以及&-葡萄糖苷酶必須同時(shí)存在方能水解天然纖維素在以后的實(shí)驗(yàn)中并未獲得證實(shí)，因?yàn)槿粝扔肅1酶與底物（結(jié)品纖維素）作用，然后將C1酶與底物分開(kāi)再加入Cx酶，其結(jié)果并不能將結(jié)品纖維素水解。Wood等人以及我國(guó)的微生物工作者分離鑒定了C1酶，改變了C1酶的非水解作用的概念。認(rèn)為c1酶是一種水解酶，它不易作用于羧甲基纖維素，而能作用于結(jié)品纖維素、磷酸膨脹纖維素等，主要產(chǎn)物是纖維二糖，因而證明c1酶基本上是一種&-1，4-葡聚糖纖維二糖水解酶。Nisizawa等人發(fā)現(xiàn)Cx酶降低棉花聚合度的速度比C1酶快得多，因此認(rèn)為Cx酶先作用于纖維素，產(chǎn)生聚合度較低的碎片，C1酶從這些碎片末端開(kāi)始將其水解成可溶性糖。從這個(gè)意義而言，認(rèn)為Reese等的“C1-Cx”假說(shuō)應(yīng)該顛倒過(guò)來(lái)，變?yōu)椤癈x-C1”假說(shuō)。1980年以來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)纖維素的研究取得了突破性進(jìn)展，纖維素酶的作用方式也逐漸明朗。近期研究認(rèn)為，q、Cx都是水解酶，而且是包含多種異構(gòu)酶的水解酶。為了避免混淆Reese和Nisizawa提出的兩種截然相反的C1和Cx酶的概念，將這兩種酶根據(jù)各自的作用方式重新命名為，內(nèi)切葡聚糖酶（Endoglucanases，縮寫(xiě)為EG，又稱(chēng)CMC酶）和外切葡聚糖纖維二糖水解酶（Cellobiohydrolases，縮寫(xiě)為CBH）。EG作用于纖維素纖維內(nèi)部的非結(jié)品區(qū)，隨機(jī)水解6-1,4-糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素。CBH從纖維素鏈的末端作用，每次切下一個(gè)纖維二糖單元。6-葡萄糖苷酶（BG）將上述兩種酶水解產(chǎn)生的纖維二糖和短鏈的纖維寡糖進(jìn)一步分解為葡萄糖。纖維素的完全降解需要這三種酶的協(xié)同作用⑹。不同菌株分泌的纖維素酶的三種組分的比例都不相同。對(duì)于同種菌株，在不同的底物誘導(dǎo)下，不同的培養(yǎng)基，不同的值，不同的溫度等生長(zhǎng)條件下，它所分泌的纖維素酶的三種組分比例也不相同。3纖維素酶的菌種選育纖維素酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，需要降低纖維素酶的生產(chǎn)成本，所以新的高產(chǎn)菌株的選育是科學(xué)研究的一個(gè)重要課題。纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育手段主要有常規(guī)理化誘變、基因重組技術(shù)、基因定位突變技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)。常規(guī)理化誘變：雖然存在著偶然性大，不能定向及工作量大等不足，但在纖維素酶微生物的遺傳改造上依然為一種有效手段。從纖維素酶的研究歷史來(lái)看，現(xiàn)在使用的許多高酶活菌株都是通過(guò)該方法獲得的。美國(guó)Rutergs[7]大學(xué)研究組（1979）在微生物遺傳調(diào)控分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的篩選抗阻遏代謝纖維素酶微生物突變體的方法，為常規(guī)理化誘變減少了很多盲目性。并且在他們的研究工作中發(fā)現(xiàn)突變株的濾紙酶活和可溶性蛋白均很大程度上超過(guò)了出發(fā)菌株。國(guó)內(nèi)中科院微生物研究所董志揚(yáng)等冏（2000）用康寧木霉通過(guò)Y射線和亞硝基胍交替處理誘變出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株T801，比出發(fā)菌株產(chǎn)酶能力提高1.77倍；張苓花等（1998）采用康寧木霉W-925、J-931，經(jīng)過(guò)濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線(15W、30cm、2min)復(fù)合誘變得到了產(chǎn)酶活性高的菌種。產(chǎn)纖維素酶菌菌種易退化，退化后其產(chǎn)酶力明顯下降，其原因可能有三個(gè)方面：經(jīng)誘變篩選的菌種發(fā)生回復(fù)突變；自然負(fù)突變；菌種長(zhǎng)時(shí)間低溫斜面保藏會(huì)在分生孢子上長(zhǎng)出次生菌絲，而次生菌絲所形成的分生孢子生命力弱，這可能是菌種退化的主要原因。因此，選擇合適的菌種保藏方法可減緩菌種退化速度?；蛑亟M技術(shù)：纖維素酶基因克隆是以得到纖維素酶過(guò)量生產(chǎn)為主要目的而進(jìn)行的。此類(lèi)研究工作起始于20世紀(jì)70年代末，80年代在國(guó)外已有約80個(gè)組分的基因被克隆，但表達(dá)、分泌均很弱。由此逐漸轉(zhuǎn)向應(yīng)用基因工程方法組建有新特性的纖維素酶分子9。十幾年來(lái)基因重組技術(shù)發(fā)展迅猛，纖維素酶系中的一些基因已在20多種細(xì)菌和真菌中克隆并在大腸桿菌或其它受體菌中得到表達(dá)。這些工作為我們了解纖維素酶基因的遺傳背景，進(jìn)而構(gòu)建高活性的菌株奠定了良好的基礎(chǔ)。酶基因重組的工作主要集中在細(xì)菌纖維素酶。KimU。］等克隆AquifexaeolicusVFS編碼EG的ec18Y基因，在.E.coliXLl-Blue中表達(dá)成功，酶CEL8Y可耐80°C的高溫。一般克隆子的檢測(cè)主要由CMC加剛果紅顯色檢出，但這樣會(huì)影響外切葡萄糖昔酶基因，以及在纖維素降解中不直接起催化作用的酶的基因克隆子檢出。因此，Kluepfel建議應(yīng)該選擇更多的檢出底物及克隆子的檢出方法。纖維素酶基因克隆受體菌目前主要是大腸桿菌，雖然.E.coli作為受體菌有其公認(rèn)的優(yōu)點(diǎn)，但是由于該菌很少分泌蛋白質(zhì)，因此現(xiàn)在許多學(xué)者把受體菌的工作轉(zhuǎn)移到枯草芽抱桿菌(B.Subtills)、釀酒酵母(S.Cerevisiae)、乳糖發(fā)酵桿菌(BrevibacteriumLactofermentum)等。近年來(lái)真菌纖維素酶基因克隆的工作報(bào)道不斷增加。最早的報(bào)告始于1983年Shoemaker和Teerl11］他們分別在不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了Teresi外切纖維二糖水解酶工基因的克隆。他們先制備反轉(zhuǎn)錄DNA探針，引入噬菌體構(gòu)建木霉的基因文庫(kù)，再用鑒別雜交進(jìn)行篩選，然后用mRNA雜交選擇和DNA序列分析鑒定CBH1基因。其不同之處只是所選擇菌株有所不同，結(jié)果有所差別，但都分別取得了進(jìn)展，使得纖維素酶基因克隆的工作從細(xì)菌擴(kuò)展到真菌，從內(nèi)切酶基因擴(kuò)展到外切酶基因。基因定位突變技術(shù)：基因定位突變技術(shù)工作起步于八十年代中后期。為了有效地完成基因定位突變，必須了解纖維素酶蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的活性部位，以便有效地在基因水平上改變活性部位氨基酸殘基的密碼子，進(jìn)而改變纖維素酶的活性。目前已提出了3種主要應(yīng)用于確定纖維素酶活性的方法，即與標(biāo)記試劑的親合性能、特定的化學(xué)修飾、以及分析纖維素酶與抑制劑及底物結(jié)合后的三維構(gòu)象。其中后者比較困難，主要由于很難得到纖維素酶的品體，因而無(wú)法通過(guò)X-衍射分析其三維構(gòu)象。最早對(duì)T.reesiexoi基因定位突變研究始于1987年chen的工作。目前該技術(shù)己被系統(tǒng)地應(yīng)用于許多纖維素酶的改造中，并已有提高纖維素酶熱穩(wěn)定性的多篇成功報(bào)道。細(xì)胞融合技術(shù)：通過(guò)細(xì)胞工程提高纖維素酶活性的工作始自日本外山信男（H.tayama）等學(xué)者。他們利用原生質(zhì)體融合技術(shù)研究.T.reesi的遺傳，所選擇的兩個(gè)親本菌株為QM9414等，其融合率為0.9-4*10-4，得到的融合子其穩(wěn)定的羧甲基纖維素酶（CMCase）活性比親本高l倍，后來(lái)工作進(jìn)一步擴(kuò)大到不同種木酶之間的融合。國(guó)內(nèi)在纖維素酶微生物原生質(zhì)的制備、再生以及融合也都進(jìn)行了探索。4纖維素酶的生產(chǎn)工藝要獲得較高的酶產(chǎn)量，發(fā)酵方法也是非常重要的。纖維素酶的生產(chǎn)主要有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種方式。固態(tài)發(fā)酵雖有設(shè)備簡(jiǎn)單、投資少的優(yōu)點(diǎn)，但發(fā)酵水平不穩(wěn)定、生產(chǎn)效率低、易污染雜菌、不適于大規(guī)模生產(chǎn)；而液態(tài)深層發(fā)酵由于具有培養(yǎng)條件容易控制、不易染雜菌、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，已成為國(guó)外重要的研究和開(kāi)發(fā)工藝［⑵。液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝過(guò)程是將玉米秸桿等纖維材料粉碎到20目以下后進(jìn)行滅菌處理，送發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，同時(shí)加入纖維素酶菌種，發(fā)酵時(shí)間約為70h，溫度控制低于60°C，采用凈化后的無(wú)菌空氣從罐底通入進(jìn)行物料的氣流攪拌，發(fā)酵完的物料經(jīng)壓濾機(jī)壓濾、超濾濃縮，噴霧干燥，制得纖維素酶產(chǎn)品。液體發(fā)酵法動(dòng)力消耗大，設(shè)備要求高，但原料利用率高，生產(chǎn)條件易控制，產(chǎn)量高，勞動(dòng)強(qiáng)度小，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。隨著市場(chǎng)的成熟，液體發(fā)酵工藝的發(fā)展以及菌種性能的提高，采用液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶是必然趨勢(shì)。日本過(guò)去多用固體發(fā)酵生產(chǎn)，后來(lái)由于這種方法難于監(jiān)控，某些組分常常吸附于固體殘余物上，增加了提取難度，不利于現(xiàn)代化流水作業(yè)，于是不少改為液體深層發(fā)酵。美國(guó)一直都是使用液體深層發(fā)酵方法，并在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)了分批發(fā)酵法、連續(xù)發(fā)酵法、二次發(fā)酵法以及細(xì)胞循環(huán)法等等，大大提高了酶活，降低了成本。近十幾年來(lái)，纖維素酶的固定化研究成為了該領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。雖然大部分工作還停留在實(shí)驗(yàn)室和中試階段，但取得的成就還是令人鼓舞的。實(shí)踐證明纖維素酶的固定化是提高素酶使用效率、降低生產(chǎn)成本的一種十分有效的方法。尤其是在纖維素酶固定化基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的固定菌體生長(zhǎng)細(xì)胞的技術(shù)，會(huì)因其特有的實(shí)用優(yōu)點(diǎn)，將成為今后纖維素酶領(lǐng)域的主要研究方向之一［13］。夏黎明等采用多孔塑料吸附固定在里氏木霉菌絲細(xì)胞，以硫酸鹽紙漿為底物，重復(fù)分批發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，該方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，易于擴(kuò)大，具有明顯的優(yōu)越性。固定化菌絲細(xì)胞可以在載體上保持一定的動(dòng)態(tài)平衡，產(chǎn)酶能力穩(wěn)定，至少可連續(xù)使用40天。在固定化細(xì)胞產(chǎn)酶過(guò)程中，諸如產(chǎn)酶周期、pH值等因子的變化規(guī)律與游離細(xì)胞發(fā)酵基本相似，但酶活力明顯提高，而且粗酶液中游離菌絲很少。固定化菌絲生產(chǎn)的酶液對(duì)木質(zhì)纖維原料的降解能力很強(qiáng)。當(dāng)每克底物的酶用量為濾紙酶活力151U/時(shí)，酶解得率可達(dá)86%；酶用量在20IU以上時(shí)，酶解得率可達(dá)90%以上。固定化酶與水溶性酶相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)：（1）極易將纖維素酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)；（2）可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)進(jìn)行分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；（3）可提高纖維素酶的穩(wěn)定性；（4）產(chǎn)物溶液中酶的殘留較少，簡(jiǎn)化了提純工藝；（5）酶的使用率提高，降低成本［14］。5發(fā)展前景隨著對(duì)纖維素酶的研究的深入，纖維素酶必將在食品、飼料、環(huán)境保護(hù)、能源和資源等各個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。加大對(duì)纖維素酶的研究和開(kāi)發(fā)力度，改變目前規(guī)模較小、工藝設(shè)備落后、菌種酶活低、生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)技術(shù)水平低下的現(xiàn)狀，發(fā)展具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新酶種、新產(chǎn)品，滿(mǎn)足市場(chǎng)需求是當(dāng)前纖維素酶研究工作者們的一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。參考文獻(xiàn)［1］高論江，董全，唐春紅.纖維素酶的研究進(jìn)展及前景展望.江蘇食品與發(fā)酵，2007，4.⑵顧方媛，陳朝銀，石家驥，錢(qián)世鈞.纖維素酶的研究進(jìn)展及發(fā)展趨勢(shì).微生物學(xué)，2008，28（1）.［3］劉小杰，何國(guó)慶，陳啟和.康寧木霉刀5纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2003，37（5）劉小杰.康氏木霉纖維素酶的發(fā)酵及其對(duì)稻草降解利用的初探.浙江大學(xué)博士學(xué)位論文.Reese，E..T，SiuR.GandLevinson，H.S.Thebiologicaldegradationof