常用標(biāo)本制備技術(shù)

1/13常用標(biāo)本制備技術(shù)一、常用光鏡標(biāo)本制備技術(shù)切片標(biāo)本的制備：常用的切片方法為石蠟切片，其制備程序如下：⑴取材從動物身體割取所需的穎組織一小塊〔厚度約0.5厘米〕。手術(shù)愈快愈好，以防組織的死后變化。⑵固定把切取的小塊組織，快速投入預(yù)先配好的固定液［10%畐爾馬林、0.5%鋨酸、包氏液、岑克氏液、卡氏等固定液］中固定，使組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性，組織塊硬化，以保存組織細(xì)胞原有的形態(tài)。⑶沖洗〔洗滌〕組織塊自固定液取出后，須經(jīng)流水沖洗或乙醇洗滌，使組織中含有的固定液全部除去，直至洗凈為止。⑷脫水的目的在于除去組織中的水分。由于組織中的水分和石蠟是不相溶的，為不使組織塊在脫水時(shí)產(chǎn)生收縮，所以肯定要經(jīng)過各級濃度的脫水劑〔如乙醇等〕將水分脫凈。⑸透亮組織塊脫水后，須經(jīng)既可和乙醇相混，亦可作石蠟溶劑的透亮劑〔如二甲苯〕透亮，使組織中的乙醇被透亮劑所替代，才能浸蠟包埋。⑹浸蠟是將包埋劑〔石蠟〕透入整個(gè)組織的過程。石蠟透入組織需要肯定的溫度〔石蠟熔點(diǎn)〕。所以浸蠟都在恒溫箱中進(jìn)展。⑺包埋制備肯定外形的容器〔如紙盒等〕，倒入熔化的石蠟，快速夾取浸透石蠟的組織塊放入盒內(nèi)，待外表石蠟?zāi)毯篑R上將容器投入水中，使它凝固成蠟塊。⑻切片組織塊經(jīng)上述處理后，不僅變硬，且有石蠟支撐，可用切片機(jī)將包埋組織的蠟塊切成薄片，一般厚度是5 8微米。⑼貼片把由切片機(jī)切下的蠟條，分割成小段，分別排放于滴有蒸餾水的載玻片上，在展片臺上微熱，使皺褶的蠟片伸展平正。45C3~4小時(shí)，使切片干燥。脫蠟與復(fù)水組織切片的脫蠟等過程是在染色缸中進(jìn)展的，因此須預(yù)先準(zhǔn)備干凈的染色缸，并分別放入二甲苯、各級濃度的乙醇及染料溶液，按挨次貼好標(biāo)簽。染色前須先進(jìn)展脫蠟和復(fù)水，即用二甲苯溶去切片上的石蠟后再經(jīng)各級濃度乙醇〔自高濃度到低濃度〕下行到水的過程。由于沒有經(jīng)過復(fù)水處理的切片不能用水溶性染料染色，所以在染色前必需再度復(fù)水。脫蠟與復(fù)水的步驟如下：T3?10T二甲苯+純乙醇〔11〕T純乙醇95%80%TT70%T50%乙醇〔以上每級乙醇停留的時(shí)間約2?5分鐘〕T蒸餾水2分鐘。染色切片染色以后可增加組織細(xì)胞構(gòu)造的比照度。常用的生物染料是蘇木素和伊H.E.染色。蘇木素是一種堿性染料，經(jīng)蘇木素染色的構(gòu)造呈藍(lán)紫色〔如細(xì)胞核〕。組織中可被堿性染料著色的構(gòu)造稱嗜堿性。伊紅是一種酸性染料，被伊紅染色的構(gòu)造呈紅色或粉紅色〔如細(xì)胞質(zhì)〕H.E.染色的程序如下：將已浸入水中的切片取出放入蘇木素染液5?10T2T0.5%鹽酸水分色數(shù)秒種〔在顯微鏡下檢查核褪至淺紅色，細(xì)胞質(zhì)及結(jié)締組織近無色〕T1TT T 0.1%氨水〔藍(lán)化〕1T5?10T1分鐘50%乙醇70%乙醇80%乙醇-90%乙醇〔2?5T T 0.5%伊紅〔95%乙醇溶液〕2?595%乙醇分色〔在顯微鏡下檢查核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)及結(jié)締組織呈粉紅色〕—95%乙醇輕洗〔洗凈玻片上剩余的伊紅染液〕。脫水已染色的組織切片，為了長期保存，又須再經(jīng)各級濃度的乙醇脫水。馬上上述已被染色的組織切片依次放入95%乙醇1分鐘—純乙醇〔I〕1分鐘—純乙醇〔II〕2?5分鐘。圍透亮的目的是除去組織切片中的乙醇，因組織中的乙醇不與樹膠相溶，所以必需用透亮劑除去乙醇后才能封藏。馬上上述已脫水的組織切片依次放入二甲苯+純乙醇〔1：1〕2?5分鐘—二甲苯〔I〕2?5分鐘—二甲苯〔I〕2?5〔15〕封固在切片上滴加中性樹膠，用蓋玻片進(jìn)展封固，保存?zhèn)溆谩C(jī)體內(nèi)有些構(gòu)造成分，需經(jīng)硝酸銀處理〔鍍銀或銀染〕時(shí)可使硝酸銀還原，形成銀的微粒附著在組織構(gòu)造上，呈棕黑色，稱這種性質(zhì)為親銀性。有些組織構(gòu)造本身不能使硝酸銀復(fù)原，需加復(fù)原劑使硝酸銀復(fù)原，稱此為嗜銀性。此外，為了顯示某些特別構(gòu)造成分，還可應(yīng)用各種特別染色方法，如雷鎖辛品紅染色液顯示彈性纖維等。在制作較硬組織〔如骨組織等〕或較大組織器官〔如眼球〕等切片，為了減輕因石蠟包埋所產(chǎn)生的收縮，可用火棉膠〔celloidin〕代替石蠟進(jìn)展浸透包埋，再進(jìn)展切片染色。為了較好地保存細(xì)胞內(nèi)的酶活性，可選用冷凍切片。它是將組織在低溫條件下快速凍結(jié)，直接切片，進(jìn)展染色。2、涂片、鋪片、磨片標(biāo)本的制備：血液等液體材料，可直接在玻片上涂片，枯燥后再進(jìn)展固定和染色。疏松結(jié)締組織和腸系膜等薄層組織，可在玻片上撕開展平，制成鋪片，待枯燥后進(jìn)行固定和染色。骨和牙等堅(jiān)硬組織除用酸〔如稀硝酸等〕脫鈣后再按常規(guī)制成切片處，還可直接研磨成薄的磨片進(jìn)展染色觀看。二、大體解剖技術(shù)操作規(guī)程及其留意事項(xiàng)一〕大體解剖標(biāo)本的收集與防腐固定處理1、收集標(biāo)本時(shí)，須登記死者的死亡緣由、性別、年齡等，辦妥自愿捐獻(xiàn)手續(xù)、家屬簽2、進(jìn)展消毒處理，避開傳染病集中。3、進(jìn)展固定防腐注射，配制5%—10%的甲醛溶液作頸總動脈與股動脈灌注，依據(jù)標(biāo)本大小選擇注射劑量。如注射溶液過濃，解剖時(shí)簡潔造成肌纖維及血管斷裂，過淡時(shí)標(biāo)本簡潔腐敗。溫度高時(shí)注射5%左右溶液，溫度低時(shí)注射10%左右溶液。依據(jù)季節(jié)氣溫的不同在5%—10%之間浮動。4、注射完后標(biāo)本在注射臺上保存一到兩天，使其毛細(xì)血管中溶液滲均勻，再行放入3%—5%的甲醛溶液中保存。5、每具標(biāo)本注射后必需在尸池中浸泡六個(gè)月后，方可進(jìn)展大體解剖，如解剖過早則不易保存。6、假設(shè)收集標(biāo)本須作鑄型標(biāo)本用，宜將標(biāo)本即時(shí)放血，取材越穎越好。剩余局部作局部注射保存。假設(shè)作關(guān)節(jié)韌帶等標(biāo)本，取材后馬上將肌肉等準(zhǔn)時(shí)剝離，以防腐敗發(fā)臭。收集腐敗標(biāo)本后可作沙埋腐蝕后取骨架為標(biāo)本。〔二〕大體標(biāo)本解剖1、將收集保存六個(gè)月以上的標(biāo)本撈出、沖洗后，放入尸體臺即可進(jìn)展解剖。2、解剖前必需將鑷、鉗、剪、刀等工具預(yù)備完好，方可動手操作。視其操作部位，必需生疏所作部位解剖層次構(gòu)造，用圓刀切開皮膚并剝離之，用尖刀或剪等修潔神經(jīng)、血管、肌肉等構(gòu)造。大體標(biāo)本制作之關(guān)鍵在于生疏層次構(gòu)造和嫻熟的操作技巧。否則易切斷或破壞相關(guān)構(gòu)造，且制作的標(biāo)本不美觀。假設(shè)作系解教學(xué)標(biāo)本宜實(shí)行兩側(cè)分別以深、淺層制作。完成〔三〕特別標(biāo)本制作1、鑄型標(biāo)本依據(jù)所取材料，按需要處理?！?〕配制好鑄型劑并加不同染料〔一般示紅色動脈，示靜脈藍(lán)色，示膽道綠色，示神經(jīng)黃色等〕?！?〕分別實(shí)行不同腐蝕法，腐蝕后沖洗，裝瓶保存。2、包埋標(biāo)本〔1〕取出所需材料修潔涼干〔有條件可抽空包埋〕。按需要選擇好包埋材料。〔3〕包埋造型。3、xx標(biāo)本制作〔1〕按要求進(jìn)展標(biāo)本取材?！?〕xx、涂色?！?〕裝瓶、保存〔假設(shè)標(biāo)本上涂顏色，不宜保存在本院配方的保存液中，以防脫色，仍須保存在5%—10%的甲醛溶液中〕。三、人體骨骼標(biāo)本雙氧水法制作〔一〕目的利用局解后的廢舊材料制作人體骨骼標(biāo)本〔二〕材料經(jīng)防腐固定的局解后尸體標(biāo)本、工業(yè)用雙氧水、汽油和帶蓋標(biāo)本箱?！踩撤椒?、取材：取骨質(zhì)無損的標(biāo)本，整體的或局部的均可。2、軟組織處理：將大塊軟組織包括筋膜、肌肉、內(nèi)臟、腦等除掉后，常溫下浸入 5%-10%的雙氧水中，利用雙氧水放氧產(chǎn)生氣泡的機(jī)械作用使軟組織松動，15-30天后取出，用清水沖洗后將骨膜撕掉，但韌帶、關(guān)節(jié)囊、軟骨、肌腱、骨間膜等可按需修潔保存〔如做散的骨標(biāo)本，則可將這些軟組織很簡潔地去除掉〕。3、脫脂：將上述材料涼干后入汽油中脫脂4個(gè)月。留意材料要枯燥，容器要密封，中途更換1次汽油即可。4、清潔和保存：將脫脂后的材料置通風(fēng)處讓汽油揮發(fā)，然后浸入1%的洗衣粉內(nèi)將外表的油漬洗凈，再用清水沖洗干凈。之后，置陰涼枯燥處風(fēng)干〔為防止肋骨縮水變形，可用木條或有機(jī)玻璃支撐固定，待干后拆掉〕，涂刷清漆兩遍即可保存。6/13〔四〕結(jié)果及評價(jià)制作出的骨骼標(biāo)本干凈美觀，構(gòu)造完整，骨的連結(jié)自然真實(shí)，骨間膜、椎間盤、肋軟骨、恥骨間盤、韌帶、關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)軟骨等結(jié)實(shí)地與骨連結(jié)在一起，胸廓，骨盆，脊椎等完全保持了其原來形態(tài)。承受雙氧水浸泡處理軟組織，有以下優(yōu)點(diǎn)：〔1〕雙氧水放氧產(chǎn)生氧泡的物理作用使與骨結(jié)合嚴(yán)密的軟組織松動，與骨較易分別，而枯燥后這些軟組織與骨的結(jié)合又變得嚴(yán)密結(jié)實(shí)了。〔2〕經(jīng)雙氧水浸泡后骨標(biāo)本脫脂效果很好。3〕低濃度的雙氧水對骨質(zhì)的腐蝕性小，在常溫下進(jìn)展，處理的時(shí)間簡潔掌握。四、辣根過氧化物酶〔HRP法操作規(guī)程〔一〕試驗(yàn)?zāi)康奶接懩骋会樉难ㄎ粎^(qū)傳入神經(jīng)元的節(jié)段性分布?！捕乘幤泛驮噭〩RP：SigmaTypeIVR：Z3.2硝普鈉〔xx化學(xué)試劑廠〕聯(lián)大茴香胺〔xx化學(xué)試劑廠〕過氧化氫〔xxxx化工廠〕〔三〕儀器設(shè)備與材料100ml500ml1000ml2023ml籠、50U微量注射器、周密試紙、一般光學(xué)顯微鏡，等。四〕試驗(yàn)對象本院動物室供給的家兔，體重2023±20g〔五〕試驗(yàn)環(huán)境18?25C,60%?75%?！擦巢僮鞑襟E1．主要溶液的制備2O%HRP20口、HRP5mg力口20□生理鹽水即此液。22%多聚甲醛加1.25%戊二醛0.1MPH7.4)。①0.1M磷酸緩沖液的制備：液：NaH2PO4H2O27.6g1000ml。液：Na2HPO4?12H2O71.6g1000ml.I190ml、I810ml2023ml即得0.1MPH7.4)。②2%多聚甲醛0.1M磷酸緩沖液的制備:20g多聚甲醛加0.1M1000ml即得此液。③2%多聚甲醛1.25%戊二醛0.1M:25%50ml2%多聚甲醛0.1M磷酸緩沖液至1000ml即得(3)Tris液的配制①取3.6ml300ml。②取4.08g無水醋酸鈉加蒸餾水至150ml。③取上液①279ml和上液②126mlTris液。PH為4.4則可用。(4O-D法中有關(guān)溶液配制①A液的配制取O.IMTris液10ml、0.2%50ml200mg100ml80mg加蒸餾水至40ml、1.5%H2O20.8mlA液。②B液的配制取O.IMtris10ml、0.2%50ml8g140mlB液。③C液的配制取Mtris液20ml、1010/13%100ml280mlC液。定穴及針入xx：依據(jù)《針灸學(xué)》[1]、《獸醫(yī)針灸手冊》[2]確定。動物分組、xxHRP引入方式：將試驗(yàn)用家兔隨機(jī)分成5組，即穴區(qū)組神經(jīng)干組、切斷神經(jīng)組、切斷血管組和空白比照2%40mg/kg體重，進(jìn)展腹腔麻醉。穴區(qū)組、切斷神經(jīng)組、切斷血管組，均在家兔某一目標(biāo)穴區(qū)直接注射20%HRP20gl,神經(jīng)干組在家兔目標(biāo)穴區(qū)下神經(jīng)干內(nèi)注射20%HRP20山空白比照20g生理鹽水。動物灌注：4?5天進(jìn)展，開胸經(jīng)左心室升主動脈插管，同時(shí)剪開右心耳灌注如下藥如下藥液：(1)0?~4C300ml。(2)0?▼4C1000ml(3)0?-4C2%多聚甲醛1.25%戊二醛0.1M1000ml300ml700ml緩慢滴入。全過程約40分鐘。(4)0?4C10%蔗糖0.1M800ml300ml500ml30分鐘。取出兩側(cè)相應(yīng)節(jié)段〔據(jù)大體解剖學(xué)而定〕全部脊神經(jīng)節(jié)，并放入 10%蔗糖0.1M磷酸緩沖液內(nèi)。置冰箱內(nèi)過夜。40?50微米，并收集于5.取材：11/130.1M磷酸緩沖液中。成色反響〔O-DA液、B液、C液配制見上〕〔1〕0?4C蒸餾水沖洗切片三次?！?〕A30分鐘〔置冰箱〕?！?〕0?4C蒸餾沖洗切片三次?！?〕B30分鐘〔置冰箱〕。〔5〕0?4C蒸餾水沖洗切片三次?！?〕C液中〔置冰箱〕。蛋白甘油貼片1%中性紅復(fù)染，脫水透亮，最終中性樹膠封片，光鏡下觀看?！财摺吃囼?yàn)結(jié)果及評價(jià)〔以“上巨虛”穴區(qū)為例〕1.未注射側(cè)的狀況：全部的試驗(yàn)動物在未注射側(cè)的切片上，各脊神經(jīng)節(jié)都未消滅標(biāo)記細(xì)胞。2.五組試驗(yàn)動物在脊神經(jīng)節(jié)消滅標(biāo)記細(xì)胞的狀況〔1〕穴區(qū)組在切片上，可見注射側(cè)脊神經(jīng)節(jié)L4?S2節(jié)段中都消滅了標(biāo)記細(xì)胞，以L7?S2節(jié)段的標(biāo)記細(xì)胞為最多。占總數(shù)的83%,L5、L4L740%S1為最多，占總數(shù)的26%。其它各節(jié)段都未消滅標(biāo)記細(xì)胞。(2)神經(jīng)干組在切片上，可見注射側(cè)在脊神經(jīng)節(jié)記細(xì)胞。以L7?S2節(jié)段的標(biāo)記細(xì)胞為最多。占總數(shù)的

L1?S3節(jié)段中消滅了標(biāo)68.2%L5L2L4L3S3L2L1L7為最多，占總數(shù)31.3%。段以S1為最多，占總數(shù)的21%。其它各節(jié)段都未消滅標(biāo)記細(xì)胞。(3)切斷神經(jīng)組、空白比照組在切片上各脊神經(jīng)節(jié)都未消滅標(biāo)記細(xì)胞。(4)切斷血管組在切片上可見注射側(cè)脊神經(jīng)節(jié)L7?S2為最多。占總數(shù)的

L4?S2節(jié)段中都消滅了標(biāo)76.9%L6L5L4L7節(jié)段為最多。占總數(shù)的31.7%S1節(jié)段為最多，占總數(shù)的2.4%。其它各節(jié)段都未消滅標(biāo)記細(xì)胞。本試驗(yàn)用Leitz測微尺測定試驗(yàn)中全部消滅細(xì)胞的大小，其穴區(qū)組、神經(jīng)干組、切斷血75.6%、76.1%、74%，其中又以小型標(biāo)記細(xì)胞為最多，各占總數(shù)的42.1%、4