植物細(xì)胞工程知識點(diǎn)

緒論：細(xì)胞工程(cellengineering)：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法， 借助工程學(xué)的試驗方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上爭論改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性， 以獲得特定的細(xì)胞， 細(xì)胞產(chǎn)品或生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科； 廣義：全部的生物組織， 器官及細(xì)胞離體操作和培育技術(shù)；狹義：細(xì)胞融合和細(xì)胞培育技術(shù)；細(xì)胞學(xué)說：細(xì)胞是生物構(gòu)造，功能和發(fā)育的根本單位；1902，Haberlandt 《植物細(xì)胞離體培育試驗》 ；B族維生素的應(yīng)用： White 等；興奮素的覺察：Miller；單個胡蘿卜細(xì)胞形成體細(xì)胞胚： 1958，Steward；最早爭論莖尖培育人參：羅士韋；植物細(xì)胞工程技術(shù)在育種上的應(yīng)用〔簡答〕 ：1，快速獲得特別倍性材料：單倍體，三倍體2，抑制遠(yuǎn)緣雜交不親和性 3，抑制雜種胚早期夭折 4，導(dǎo)入外源基因 5，突變體選擇 6，種質(zhì)資源儲存植物胚胎干細(xì)胞： 莖端分生細(xì)胞，形成層分生細(xì)胞和薄壁細(xì)胞； 組織干細(xì)胞： 分化程度高的一些細(xì)胞； 脫分化〔dedifferentiation): 分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)，形成胚性細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織的現(xiàn)象； 脫分化條件： 創(chuàng)傷和外源激素第一章：分化〔differentiation導(dǎo)致細(xì)胞形成不同構(gòu)造，引起功能轉(zhuǎn)變或潛在發(fā)育方式轉(zhuǎn)變的過程；脫分化〔dedifferentiation):培育條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程；再分化〔redifferentiation離體條件下，細(xì)胞脫分化后，無序生長的細(xì)胞及其愈傷組織重進(jìn)入有序生長再生為個體的過程細(xì)胞全能性〔celltotipotenc：全能性差異：植物頂端分生組織細(xì)胞較強(qiáng)；完全失去分裂才能的細(xì)胞，如細(xì)胞核開頭解體的篩管和木質(zhì)部局部沒有；細(xì)胞脫分化過程中的生理活動與細(xì)胞構(gòu)造變化： 1，細(xì)胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消逝；2，核體積增加并逐步移位至細(xì)胞中心 3，細(xì)胞器增加 4，其中細(xì)胞脫分化的重要特點(diǎn)：液泡蛋白體的顯現(xiàn)，質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體 5，細(xì)胞開頭脫分化的標(biāo)志：蛋白體的顯現(xiàn)，同時細(xì)胞質(zhì)密度增加；〔填空〕極性〔 polarity〕是植物細(xì)胞分化中一個根本現(xiàn)象；細(xì)胞的不均等分裂是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志；極性生長的重要緣由是細(xì)胞內(nèi)不同方向 Ca+梯度分布；植物細(xì)胞離體培育再生兩條途徑是器官發(fā)生體和細(xì)胞胚胎發(fā)生離體培育中器官發(fā)生的方式： 1，先芽后根，較為普遍； 2，先根后芽； 3，愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株；激素對器官分化的調(diào)控： IAA與KT 比例高時利于根的形成，低時利于芽的形成；植物多肽PSK可極大加強(qiáng)根本激素的作用成效；體細(xì)胞胚的形成： 1，從外植體上直接發(fā)生； 2，經(jīng)過愈傷組織：誘導(dǎo)形成愈傷組織；胚性化；體細(xì)胞胚形成；高濃度 2,4-D可誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生；轉(zhuǎn)到低濃度使胚性化； 3，細(xì)胞懸浮培育的體細(xì)胞胚發(fā)生；胚性細(xì)胞團(tuán)：成簇成團(tuán)的體積小而細(xì)胞質(zhì)致密的細(xì)胞；體細(xì)胞胚與合子胚的不同： 1，合子胚發(fā)育初期有明顯的胚柄，體細(xì)胞胚只有類似胚柄的構(gòu)造；2，子葉不標(biāo)準(zhǔn)； 3，體積小； 4，干物質(zhì)含量低； 5，含水量高； 6，沒有休眠其次章：16體細(xì)胞無性系變異〔 Somaclonalvariation：經(jīng)過組織培育循環(huán)顯現(xiàn)的再生植株變異組織培育是誘導(dǎo)的主要緣由； 1，體細(xì)胞再生植株的變異； 2，花粉植株的無性系變異誘變方式：體細(xì)胞人工突變，基因轉(zhuǎn)移，體細(xì)胞融合，物理誘變〔紫外線， X 射線等〕和化學(xué)誘變〔DES，EMS等〕嵌合體(mosaic)：同一有機(jī)體中同時存在有遺傳組成不同的細(xì)胞體細(xì)胞無性系變異的特點(diǎn)〔簡答〕 ：1，體細(xì)胞無性系變異是組培中較普遍現(xiàn)象 2，體細(xì)胞無性系變異可遺傳 3，體細(xì)胞無性系變異頻率顯著高于自然突變 4，體細(xì)胞無性系變異與外植體來源及培育時間有關(guān)〔填空〕分化水平高的組織產(chǎn)生的無性系比分生組織產(chǎn)生的更易變異；獲得較高頻率的體細(xì)胞無性系變異：以分化程度高的組織或細(xì)胞為外植體，在確定植物激素濃度下誘導(dǎo)愈傷，并經(jīng)較長時間的繼代培育，然后誘導(dǎo)分化再生植株，有可能得到較高頻率的體細(xì)胞無性系變異；體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)根底〔論述〕 ：染色體變異： 非整倍體；染色體斷裂，缺失，易位，基因重復(fù)和突變植物組織和細(xì)胞進(jìn)入離體培育環(huán)境后，細(xì)胞分裂的不規(guī)章性顯著增加，導(dǎo)致染色體和分子水平的變異；最常見是染色體數(shù)目變化；離體培育細(xì)胞染色體易于斷裂緣由： 細(xì)胞離體培育時分裂周期縮短，分裂速度加快，異染色質(zhì)復(fù)制落后于真染色質(zhì)，形成染色體橋，造成染色體斷裂；離體培育細(xì)胞反常有絲分裂類型：1，有絲分裂失敗或進(jìn)展無絲分裂2，核內(nèi)有絲分裂：染色體復(fù)制而細(xì)胞不分裂3，核內(nèi)再復(fù)制：DNA復(fù)制而染色體不復(fù)制4，有絲分裂時形成多極紡錘體；轉(zhuǎn)座子活化的影響： 1，轉(zhuǎn)座子活化可造成基因表達(dá)的廣泛變化， 因此無性系變異頻率才如此之高 2，轉(zhuǎn)座子具有使不活動的構(gòu)造基因活化特點(diǎn)，因此會有顯性基因 3，轉(zhuǎn)座子仍可使多拷貝基因中那些不表達(dá)的拷貝活化，提高基因表達(dá)的強(qiáng)度，即基因放大；單倍體培育細(xì)胞的無性系變異選擇抗性突變細(xì)胞株具有高效和簡潔穩(wěn)固優(yōu)越性： 隱性突變基因可以表達(dá)， 大大提高選出抗性細(xì)胞株的機(jī)率； 顯著加快了突變體的穩(wěn)固和純合過程；第三章：器皿的選擇與清洗： 不同規(guī)格三角瓶；清洗：自來水洗，烘干，泡酸，自來水洗，去離子水洗，三蒸水洗，烘干〔培育材料染菌的瓶子經(jīng)高壓滅菌后也按該程序清洗；酸液〔洗液〕 ：濃硫酸加重鉻酸鉀〕母液的配制： 1，大量元素母液：通常配成 10×濃縮液，配 1L培育基時加 100mL留意：配制時加一個溶解一個，最終加鈣 2，微量元素母液：通常配成 1000×濃縮液，配 1L培育基時加 1mL3，鐵鹽母液：通常配成 100×濃縮液，配 1L培育基時加 10mL，螯合鐵使得培育基pH上升至 6～8時，鐵離子仍保持二價，可被很好地吸取利用過濾消毒方式： 0.45或m微孔濾膜進(jìn)展過濾，如激素，誘導(dǎo)子等復(fù)合滅菌：在充分清洗后〔通常流水沖洗幾小時〕 ，75％酒精滅菌 ，0.1%升汞滅菌 5～20min，消毒劑滅菌后確定要用無菌水充分清洗滅菌方式：1，高壓滅菌 2，干熱滅菌 3，過濾滅菌 4，藥劑滅菌 5，火焰滅菌 6，熏蒸滅菌：KMnO4+HCHO 試驗室滅菌 7，紫外滅菌：無菌間及安全柜滅菌激素〔脫落酸〕：組培中主要用于胚胎或胚狀體發(fā)育的后期，抑制胚胎的過早萌發(fā)，促進(jìn)胚胎成熟，使胚胎長成外形正常的植株26生長素分裂素使用原就： 較高濃度的生長素單獨(dú)或與細(xì)胞分裂素結(jié)合使用可有效刺激培育細(xì)胞的增殖和連續(xù)生長，形成愈傷組織；培育基中 KT濃度高于 IAA 濃度時，培育物形成芽，不形成根；兩者濃度大致相等時，只誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，根本沒有器官發(fā)生；當(dāng) IAA 濃度高于KT時，培育物分化出根，不形成芽；體細(xì)胞胚胎發(fā)生〔 somaticembryogenesi) 從植物體細(xì)胞培育物中分化胚胎或胚狀體過程；第四章快繁〔rapidpropagation〕或微繁〔micropropagation〕技術(shù)：利用組培進(jìn)展快速養(yǎng)分生殖的技術(shù)快繁的應(yīng)用價值： 1，雜合植物材料的大量繁衍； 2，脫毒種苗生產(chǎn) 3，加速繁衍數(shù)量有限的特別種質(zhì)材料 4，單獨(dú)繁衍雄株或雌株外植體褐變 brooming：褐變緣由 :植物中含有多酚，創(chuàng)傷會激活多酚氧化酶，將多酚氧化為棕褐色的醌類， 使得外植體切口發(fā)生褐變， 并滲透入培育基， 嚴(yán)峻影響培育物的生長和分化，甚至致其死亡； 影響褐變因素： 木本植物外植體易褐化，特別成年樹；培育基中過高濃度的無機(jī)鹽和肌醇會加劇褐變； 6-BA和KT 有誘導(dǎo)褐化作用；強(qiáng)光和高溫會促進(jìn)褐化； 預(yù)防褐變：1，選取酚類含量低的試驗材料 2，選擇無機(jī)鹽含量低，不加肌醇的培育基 3，在弱光線或黑暗條件下培育 4，培育基中參加抗氧化劑： Vc，檸檬酸，半胱氨酸，二硫蘇糖醇和聚乙烯吡咯烷酮〔 PVP)；5，在培育基中參加 0.5%~1%活性炭，吸附醌類，留意同時提高培育基中激素濃度； 6，不斷地更換培育基再生植株方式： 1，外植體直接產(chǎn)生不定芽 2，外植體產(chǎn)生愈傷，轉(zhuǎn)移培育后產(chǎn)生胚狀體，再生植株 3，外植體產(chǎn)生愈傷，轉(zhuǎn)移培育后分化芽，再生植株；不定芽 adventiousshot 頂芽和腋芽以外任何其它器官或組織產(chǎn)生的芽組培脫毒方法： 1，高溫脫毒：病毒和植物細(xì)胞對高溫耐受力不同；熱處理脫毒又稱為溫?zé)岑煼?，分溫湯浸漬處理和熱風(fēng)處理兩種； 2，低溫脫毒也稱冷凍法 3，化學(xué)法： 2-硫尿嘧啶，8-氮鳥嘌呤， virazole〔病毒唑〕和一些蛋白質(zhì)與核酸合成的抑制劑，植物病毒鑒定方法： 1，指示植物法 2，抗血清鑒定法 3，酶聯(lián)免疫法 4，電鏡檢查法 5，RT-PCR〔填空〕1，朱至清覺察低銨離子濃度和過濾消毒的單糖顯著促進(jìn)禾谷類花粉胚的發(fā)育，建立了N6 和改進(jìn) N6培育基 2，歐陽俊聞確立單核中期的小麥花粉最適于產(chǎn)生花粉植株，較高的培育溫度有利于花粉綠苗形成 3，衛(wèi)志明首次指出大麥患病碳饑餓可大幅度提高花粉胚的產(chǎn)率；4，孫敬三覺察花粉中質(zhì)體 DNA 降解引起的質(zhì)體 RNA和蛋白質(zhì)的匱乏是白化苗形成的緣由；5，煙草“單育一號”成花 水稻“單豐一號”；單核中晚期至雙核早期的花粉最易形粉胚或花粉愈傷條件培育基： 已經(jīng)預(yù)先培育過花藥〔或其它離體細(xì)胞〕的液體培育基游離小孢子培育〔 isolatedmicrosporecultur，又花粉培育〔 pollenculture：把小子從花藥中分別出來，進(jìn)展人工培育小孢子分別培育方法： 擠壓法，散落法和器械法單倍體植株： 植物學(xué)上通常把具有配子體染色體數(shù)目的孢子體叫做單倍體植株單倍體植物在遺傳育種上的價值〔簡答〕 ：1，利用單倍體植物把握雜種分別，加快常規(guī)育種速度 2，提高常規(guī)育種的選擇效率 3，利用 H系進(jìn)展基因定位，繪制遺傳圖心形胚以后的雙子葉胚較易培育，球形胚很難培育； ABA 可抑制幼胚吸水，使其脫水枯燥，發(fā)育成熟胚胎挽救：種間或?qū)匍g雜交時，兩個基因組表達(dá)不和諧，多數(shù)情形下胚乳最先敗育，胚仍36然安康，可通過離體胚培育將雜種幼胚培育成植株，稱為胚胎挽救胚乳培育的意義： 1，胚乳細(xì)胞中儲存大量淀粉，蛋白質(zhì)和脂類，是爭論這些產(chǎn)物代謝工程的抱負(fù)系統(tǒng) 2，完全由薄壁細(xì)胞組成的均質(zhì)組織，是試驗外形發(fā)生學(xué)爭論的極好材料； 3，胚乳植株－三倍體，高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)，果實(shí)無籽；三倍體的經(jīng)濟(jì)價值：無籽果實(shí)；生物量高；品質(zhì)好；獲得三體以進(jìn)展基因定位；第五章懸浮培育 Cellsuspensionculture:將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培育基中進(jìn)展培育增殖的技術(shù)懸浮細(xì)胞系： 1，懸浮培育物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小； 2，均一性好：細(xì)胞外形和細(xì)胞團(tuán)大小大致一樣； 3，生長快速懸浮培育細(xì)胞的同步化： 1，分選法：梯度離心； Ficoll；流式細(xì)胞儀 2，饑餓法 3，抑制劑法 FdU，HU4，低溫處理：低溫處理抑制細(xì)胞分裂，再把溫度提高到正常的培育溫度，也可到達(dá)局部同步化；看護(hù)培育〔nurseculture)：在固體培育基上置入一塊活潑的愈傷組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙潤濕后將細(xì)胞接種于濾紙上， 當(dāng)培育細(xì)胞長出微小細(xì)胞團(tuán)以后， 將其肢解轉(zhuǎn)至瓊脂培育基上讓其快速生長次生代謝產(chǎn)物 secondarymotabalate：由初生代謝產(chǎn)物經(jīng)過一些特別的代謝途徑派生出來的小分子化合物意義：植物次生代謝產(chǎn)物始終是藥物和工業(yè)原料的重要來源；在保持植物抗逆性，抗病性和抗蟲性及擔(dān)當(dāng)信號分子方面起重要作用；植物細(xì)胞培育的優(yōu)勢： 可擺脫對植物資源的依靠，疼惜物種多樣性和生態(tài)環(huán)境藥用植物細(xì)胞培育步驟： 1，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生旺盛生長的愈傷組織和懸浮細(xì)胞系 2，選擇高產(chǎn)細(xì)胞系 3，生物反響器中大量培育細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)二步法培育： 第一步，愈傷培育在生長培育基上使細(xì)胞快速增殖；其次步，細(xì)胞生長通過指數(shù)生長期后，轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)培育基上進(jìn)展其次步培育，以獲得最高次生產(chǎn)物產(chǎn)量；誘導(dǎo)子〔elicitor)：一類能引起植物細(xì)胞代謝強(qiáng)度轉(zhuǎn)變或代謝途徑轉(zhuǎn)變的物質(zhì)，主要指生物來源的化合物，如寡糖，多糖等；第六章原生質(zhì)體〔protoplas：植物細(xì)胞中，除細(xì)胞壁以外的成分分別原生質(zhì)體的方法： 1，機(jī)械法：葉肉或其它細(xì)胞放在高滲的蔗糖溶液中，使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分別，原生質(zhì)體收縮成球形，完全脫離細(xì)胞壁；剪碎組織，可釋放原生質(zhì)體；缺點(diǎn)：產(chǎn)量低，無法從分生組織分別原生質(zhì)體； 2，酶法雙子葉植物的幼葉， 子葉，根和下胚軸的切段通常被用來制備原生質(zhì)體；禾谷類植物， 疏松易碎的愈傷或懸浮培育的細(xì)胞是制備原生質(zhì)體的抱負(fù)材料酶溶液的配制：為保持釋放出的原生質(zhì)體的活力和膜穩(wěn)固性， 要求酶液滿足以下條件：1，酶液滲透壓必需與處理細(xì)胞的滲透壓相像：同一種植物，子葉和下胚軸游離原生質(zhì)體時需要的滲透壓最高， 愈傷次之，胚性懸浮細(xì)胞要求最低； 可用原生質(zhì)體培育基做溶劑，其滲透壓適宜； 2，酶液添加 CaCl2· 2H2O,KH2PO4 和葡聚糖硫酸鉀以提高原生質(zhì)體膜的穩(wěn)固性；仍可參加 AgNO3 削減酶解產(chǎn)生的乙烯，參加過氧化物歧化酶減輕O2自由基對細(xì)胞膜損耗，從而提高原生質(zhì)體植板率； 3，MES〔嗎啉乙基磺酸〕作pH緩沖調(diào)劑劑對于保持酶解物的酸堿環(huán)境起緩沖作用，增加原生質(zhì)體的釋放量和穩(wěn)固性；4，酶溶液最適 pH范疇為 酶液配好后，過濾滅菌備用；46原生質(zhì)體活力檢測方法〔FDA〔Fluoresceindiacetate，熒光素雙醋酸鹽〕活體染色：FDA能透過原生質(zhì)體膜，在內(nèi)酯酶作用下水解為不能排出的，累積在質(zhì)膜內(nèi)的熒光素；在熒光顯微鏡下觀看時，凡發(fā)淡綠熒光的都是活的原生質(zhì)體植物細(xì)胞的離體受精過程： 1，精細(xì)胞分別： 三細(xì)胞花粉：禾本科與十字花科植物，花粉中含有一個養(yǎng)分細(xì)胞和兩個游離在養(yǎng)分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的精細(xì)胞，為三細(xì)胞花粉；二細(xì)胞花粉：茄科和百合科植物， 花粉中有一個養(yǎng)分細(xì)胞和一個生殖細(xì)胞， 為二細(xì)胞花粉；花粉萌發(fā)后，生殖細(xì)胞在花粉管中分裂形成兩個精子；三細(xì)胞花粉，可以直接從成熟花粉中分別精子； 二細(xì)胞花粉，需要先進(jìn)展花粉的離體培育，待精子形成后，再從花粉管中分別精子； 2，三細(xì)胞花粉 精細(xì)胞分別方法 ：滲透壓沖擊法：花粉置于低滲溶液中，吸水裂開，釋放出精細(xì)胞；經(jīng)低速離心，得到精細(xì)胞；研磨法：成熟花粉懸浮于適當(dāng)溶液中，研磨使花粉裂開，釋放精細(xì)胞；二細(xì)胞花粉花粉精細(xì)胞分別方法：離體培育法：花粉在液體培育基中人工萌發(fā)， 待形成精細(xì)胞后， 用滲透壓沖擊或研磨使花粉管裂開；活體－離體法： 先將花粉授在柱頭上，花粉萌發(fā)并產(chǎn)生精子后，用滲透壓沖擊法分離；改進(jìn)的活體－離體法； 3，卵細(xì)胞的分別： 可先分別胚囊，從中分別卵細(xì)胞也可直接從胚珠中分別卵細(xì)胞： 胚囊分別技術(shù)－酶解振蕩法； 生活胚囊的分別方法： 胚珠放在酶液中，酶液：纖維素酶，果膠酶，半纖維素酶，蝸牛酶或崩潰酶；酶解－滲透壓沖擊法4，卵細(xì)胞與胚囊其它細(xì)胞的分別： 酶解－解剖法：優(yōu)點(diǎn)：分別率較高；缺點(diǎn)：酶解如過度或清洗不完全，會對后期合子培育產(chǎn)生不利影響；第七章體細(xì)胞雜交〔 somatichybridization〕：完全不經(jīng)過有性過程，只通過體細(xì)胞融合制造雜種的方法；又稱原生質(zhì)體融合〔 protoplastfusio：指將植物不同種，屬，甚至科間的原生質(zhì)體通人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)展離體培育，使其再生雜種植株的技術(shù)；胞質(zhì)雜種〔cybrid：種1974，Kao建立 PEG法異核體〔hetrokaryo：不同來源原生質(zhì)體融合形成的雜種原生質(zhì)體；原生質(zhì)體融合種類： 1，對稱融合 2，非對稱融合原生質(zhì)體融合手段： 1，自發(fā)融合 2，誘發(fā)融合