誘變物質(zhì)的微核測(cè)試

誘變物質(zhì)的微核測(cè)試一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解細(xì)胞微核形成機(jī)理及其形態(tài)特點(diǎn)2、學(xué)習(xí)植物根尖細(xì)胞的微核檢測(cè)方法二、實(shí)驗(yàn)原理微核（micronucleus,簡(jiǎn)稱(chēng)MCN）,也叫衛(wèi)星核，是真核類(lèi)生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，是染色體畸變?cè)陂g期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。微核往往是各種理化因子，如輻射、化學(xué)藥劑對(duì)分裂細(xì)胞作用而產(chǎn)生的。在細(xì)胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應(yīng)在主核1/3以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具合成DNA的能力。一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產(chǎn)生的。有實(shí)驗(yàn)證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在分裂過(guò)程中行動(dòng)滯后，在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核之外的核塊。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。已經(jīng)證實(shí)，微核率的大小是和作用因子的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，這一點(diǎn)與染色體畸變的情況一樣。所以許多人認(rèn)為可用簡(jiǎn)易的周期微核計(jì)數(shù)來(lái)代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計(jì)數(shù)。由于大量新的化合物的合成，原子能的應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出等都存在污染環(huán)境的可能性，欲了解這些因素對(duì)機(jī)體潛在的遺傳危害，需要有一套高度靈敏，技術(shù)簡(jiǎn)單易行的測(cè)試系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境的變化。只有真核類(lèi)的測(cè)試系統(tǒng)更能直接推測(cè)誘變物質(zhì)對(duì)人類(lèi)或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測(cè)試是一種比較理想的方法。目前國(guó)內(nèi)外不少部門(mén)已把微核測(cè)試用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、食品添加劑的安全評(píng)價(jià)，以及染色體遺傳疾病和癌癥前期診斷等各個(gè)方面。三、實(shí)驗(yàn)材料蠶豆：又稱(chēng)胡豆、佛豆、胡豆、川豆、倭豆、羅漢豆。一年生或二年生草本。為糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用作物。起源于西南亞和北非。相傳西漢張騫自西域引入中國(guó)。蠶豆含8種必需氨基酸。碳水化合物含量47%?60%。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，可食用，也可制醬、醬油、粉絲、粉皮和作蔬菜。還可作飼料、綠肥和蜜源植物種植一年生或二年生草本。莖直立，四棱，中空，四角上的維管束較大。羽狀復(fù)葉?？偁罨ㄐ?，花蝶形。莢果，種子扁平,略呈矩圓形或近于球形。蠶豆花期一般是3月?5月。蠶豆為長(zhǎng)日照作物。喜溫暖濕潤(rùn)氣候和pH6.2?8的粘壤土。器材:顯微鏡、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、濾紙、生物解剖器、250ml、1L容量瓶、玻璃棒、點(diǎn)滴板、載玻片、蓋玻片等。藥品：鹽酸、冰醋酸、龍膽紫染液、乙醇、70%酒精、重絡(luò)酸鉀、蒸餾水1.1實(shí)驗(yàn)方法1?1?1選種f浸種f催芽f處理選取顆粒飽滿(mǎn)、色澤均勻的蠶豆種子作為實(shí)驗(yàn)材料。將選取好的蠶豆種子臵于培養(yǎng)皿中加蒸餾水浸種24小時(shí)，期間換水2次。將浸泡24小時(shí)之后的蠶豆種子臵于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至生根l-2cm。稱(chēng)取1g重鉻酸鉀溶于蒸餾水中，轉(zhuǎn)入1L容量瓶中定容。將生根1-2cm的蠶豆分成16份，分別用lg/L重鉻酸鉀溶液、0.5g/L重鉻酸鉀溶液（用lg/L重鉻酸鉀溶液稀釋?zhuān)?.25g/L重鉻酸鉀溶液(lg/L重鉻酸鉀溶液稀釋)處理，對(duì)照用自來(lái)水處理。每個(gè)處理均為4份)。1.1.2蠶豆根尖微核試驗(yàn)(半數(shù)保留，恢復(fù)培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行此項(xiàng))先用卡諾氏固定液固定，后解離、染色、制片觀察卡諾氏固定液的配制：3乙醇：1冰醋酸解離液的配制：l鹽酸：l乙醇固定：切取lcm左右的根尖，用卡諾氏固定液固定24小時(shí)后棄去固定液，移入70%酒精中保存。解離：棄去固定液，用蒸餾水漂洗2次，吸凈水，加入解離液解離20分鐘，棄去解離液，蒸餾水漂洗2次。染色：截取1-2mm蠶豆根尖于點(diǎn)滴板內(nèi)，滴加適量的龍膽紫染色液染色10分鐘，加蓋玻片，壓片觀察，記錄有微核的細(xì)胞數(shù)目。直接解離、染色、制片觀察解離：切取lcm左右的根尖，用蒸餾水洗2次，吸凈水，加入解離液解離20分鐘，棄去解離液，蒸餾水漂洗2次。染色：截取1-2mm蠶豆根尖于點(diǎn)滴板內(nèi)，滴加適量的龍膽紫染色液染色10分鐘，加蓋玻片，壓片觀察，記錄有微核的細(xì)胞數(shù)目。1、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析2.1微核形成與識(shí)別：首先在低倍鏡中找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察，找到微核。在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。不同物質(zhì)對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)效應(yīng)以蒸餾水和重鉻酸鉀溶液處理蠶豆根尖后，觀察并計(jì)算其微核形成率。鏡檢發(fā)現(xiàn)微核位于細(xì)胞質(zhì)中，為與主核完全分開(kāi)的圓形或橢圓形核，大小約為主核的1/3，其染色程度與主核一致或略淺于主核。分析表明，不同處理對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)隨處理液不同而存在差異。不同處理蠶豆根尖細(xì)胞后的微核率在2%0?10%0之間。結(jié)果表明，重鉻酸鉀溶液誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞產(chǎn)生的微核率顯著高于蒸餾水（P<0.05）。3.2不同濃度重鉻酸鉀溶液對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)效應(yīng)以三種不同濃度的重鉻酸鉀溶液（規(guī)兒重鉻酸鉀溶液、0.5g/L重鉻酸鉀溶液、0.25g/L重鉻酸鉀溶液）處理根尖，觀察并計(jì)算其微核率。結(jié)果表明，處理24