蛋白提取方法

時(shí)間：二O二一年七月二十九日之邯鄲勺丸創(chuàng)作時(shí)間：二O二一年七月二十九日1資料和方法1.1資料組織和細(xì)胞的根源：儀器設(shè)備機(jī)械組織勻漿器低溫高速離心計(jì)(>40,000g)超速離心計(jì)超生細(xì)胞破裂儀超純水裝置試劑三氯醋酸(TCA)丙酮二硫蘇糖醇(DTT)尿素CHAPSPMSFEDTA乙醇磷酸考馬斯亮藍(lán)R350抑肽素A亮肽素試劑純度均應(yīng)是闡發(fā)純或以上溶液配制(1)PBS：NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO4,溶于800ml水中,用HCl調(diào)pH至7.4,用純水定容至1L；(2)EDTA儲(chǔ)藏液：18.61gNa2EDTA?2H2O,溶于70ml純水中,用10mol/LNaOH調(diào)理pH值至8.0(約需2gNaOH顆粒),定容為100ml.可高壓滅菌后分裝備用；(3)亮肽素儲(chǔ)藏液(50μg/ml,100×)10mg/ml溶于水,-75℃保管；使用時(shí)配成50μg/ml儲(chǔ)液,-20℃保存；抑肽素儲(chǔ)藏液(70μg/ml,100×)1mg/ml溶于甲醇,-75℃保存；使用時(shí)配成70μg/ml儲(chǔ)液,-20℃保存；(5)PMSF儲(chǔ)藏液(10mM,100×):17.4mgPMSF,溶于1ml異丙醇中,-20℃保存.DTT儲(chǔ)藏液(1M):0.31gDTT溶于2mlH2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT的溶液時(shí)間：二O二一年七月二十九日時(shí)間：二O二一年七月二十九日不克不及進(jìn)行高壓辦理,可過濾除菌).(7)裂解液:LysisbufferA(9Murea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)LysisbufferB(7Murea,2Mthiourea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)LysisbufferC40mMTris-base(pH9.5)inultrapureH2OLysisbufferD(8Murea,4%CHAPS,40mMTris(base),40ml)LysisbufferE(5Murea,2Mthiourea,2%SB3-10,2%CHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)LysisbufferF100μLSDSsamplesolution(1%w/vSDS,0.375MTris-HCl,pH8.8,50mMDTT,25%v/vglycerol)●CA、蛋白酶克制劑混淆物和DTT在臨用前加入.蛋白酶克制劑混淆物[3]成分終濃度蛋白酶克制劑混淆時(shí)間：二O二一年七月二十九日時(shí)間：二O二一年七月二十九日物PMSF35μg/mlor1mMEDTA0.3mg/ml(1mM)抑肽素0.7μg/ml亮肽素0.5μg/ml1.2方法組織蛋白提取方法三氯醋酸/丙酮積淀法[1](1)冰上取材,稱濕重,置液氮中凍存或直接進(jìn)行下一步；(2)在液氮中研碎樣品或使用機(jī)械勻漿器磨碎組織；(3)將粉末懸浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中；(4)蛋白–20℃積淀留宿；(5)35000×g(6℃)離心30min；將積淀重懸于含0.2%DTT的預(yù)冷丙酮中；(7)-20℃擱置1h；35000×g(6℃)離心30min；(9)在通風(fēng)櫥中讓丙酮充分揮發(fā),獲取乏味的積淀；(10)在裂解液中從頭溶解積淀（50-100mg組織需要1ml裂解液）；(11)15℃,40000×g,離心1hr；(12)用Bradford法[2]測定上清的蛋白濃度,分裝后置–75℃保存超速離心法(1)取材；(2)用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末,每1g樣品加入0.5ml裂解液,使用組織勻漿器勻漿30s；(3)組織懸液15℃,10000×g離心10min；(4)上清液4℃,150000×g超速離心45min；(5)當(dāng)心避開上層飄蕩的脂質(zhì)層,汲取離心上清6℃40,000g再次離心50min；取離心上清.Bradford法定量,分裝后置–75℃保存培育細(xì)胞蛋白提取循環(huán)凍融法(1)吸出培育液棄去,0.01mol/LPBS洗一次；(2)加入PBS,用橡膠刮采集細(xì)胞于10ml離心管中；(3)500×g,離心5min；(4)棄上清,PBS洗三次（室溫,500×g,5min）,(5)在離心管中加入1mlPBS,重懸細(xì)胞,用1ml時(shí)間：二O二一年七月二十九日時(shí)間：二O二一年七月二十九日微量加液器移入Eppendorf管中；履行Biofuge儲(chǔ)存程序8,500×g5min離心；(7)用200μl微量加液器吸出PBS,棄去；吸干殘留的PBS,估計(jì)樣品體積,加入5倍體積裂解液,巴氏滴管混勻,液氮中屢次凍融三次(每次置液氮中3s,室溫消融),DTT在第一次凍融后加入；(9)履行Biofuge儲(chǔ)存程序6,15℃,40000×g,離心1hr(Biofuge)；(10)上清Bradford法定量,積淀-75℃保存?zhèn)溆贸暺屏逊?1)取對數(shù)生長久的細(xì)胞,吸出培育液棄去,0.01mol/LPBS洗一次；(2)加入PBS,用橡膠刮采集細(xì)胞于10ml離心管中；(3)室溫,500×g,離心5min；(4)棄上清,PBS洗3次（室溫,500×g,5min）；(5)在離心管中加入1mlPBS,重懸細(xì)胞,用1ml微量加液器移入Eppendorf管中,500×g離心5min；吸干殘留的PBS,估計(jì)樣品體積,加入5倍體積裂解液,混勻,移入1.5mlEppendorf管中,冰浴中以最大功率超聲破裂細(xì)胞（3×10s）；(7)15℃,40000×g,離心1hr(Biofuge)；上清Bradford法定量,積淀-75℃保存?zhèn)溆?2結(jié)果和議論蛋白質(zhì)提取的基本步伐包括沖洗組織或細(xì)胞、裂解細(xì)胞、離心除掉膜組分等獲取溶解的蛋白質(zhì)上清.我們破裂細(xì)胞采納循環(huán)凍融法和超聲波法；破裂組織采納液氮研磨法和機(jī)械勻漿法.循環(huán)凍融法操控簡易,比較合適提取培育細(xì)胞的穩(wěn)固蛋白,我們后期實(shí)驗(yàn)對培育細(xì)胞主要采用這類破裂方法.使用超聲破裂一定注意的是控制強(qiáng)度在必定限度,即恰巧低于溶液產(chǎn)生泡沫的水平.因?yàn)楫a(chǎn)生泡沫會(huì)致使蛋白質(zhì)變性,同時(shí)要注意散熱.勻漿是機(jī)體軟組織破裂最常常使用的方法之一.因?yàn)閯驖{過程中蛋白時(shí)間：二O二一年七月二十九日時(shí)間：二O二一年七月二十九日質(zhì)被蛋白酶降解的可能性較小,因此勻漿是簡易、快速微風(fēng)險(xiǎn)小的組織破裂方法,我們實(shí)驗(yàn)室在破裂腦和脊髓組織時(shí)常常使用此法；因?yàn)樯窠?jīng)組織比較柔嫩,液氮研磨法也很合適,本實(shí)驗(yàn)中我們使用了這一方法破裂大鼠脊髓組織,中樞神經(jīng)組織因?yàn)楦缓?積淀法和高速離心法能夠使蛋白和脂類打擾物質(zhì)有效分離,但積淀法的弊端是再溶解時(shí)蛋白損失嚴(yán)重.高速離心的弊端是需要樣品量大,如BeckmanL7-65超速離心計(jì)的離心管容量為8ml,不合用小量樣品的制備.在眾多的裂解液配方中,我們主要采納9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%兩性電解質(zhì)加蛋白酶克制劑混淆物,原由是這一配方經(jīng)長久使用很穩(wěn)固,裂解效率也較高,非常合適小量細(xì)胞蛋白提取要求.針對富脂的中樞神經(jīng)組織中脂類物質(zhì)與蛋白互相作用,高濃度的尿