厭氧菌感染與診斷新進(jìn)展

趙虎復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院2017-3-302017-6-6厭氧菌感染與診斷新進(jìn)展一、厭氧菌感染厭氧菌感染率厭氧菌的感染率很高，約占總感染率的60％以上。菌血癥或敗血癥:20%-30%，肺部厭氧菌:41.1%-84.2%，牙周炎和牙根管炎:96.67%-100％。其中一部分感染為單純厭氧菌感染，但大部分感染是與需氧菌或兼性厭氧菌混合感染（82.23%）。厭氧菌感染類型

厭氧菌感染可累及機(jī)體各個(gè)部位和組織，尤以口腔、腸道和女性生殖道等寄生部位及其鄰近組織容易感染。厭氧菌感染一般癥狀厭氧菌感染的特征厭氧菌感染臨床表現(xiàn)臨床表現(xiàn)—一般癥狀細(xì)菌感染的一般癥狀全身癥狀：發(fā)熱（低熱）局部癥狀：紅、腫、熱、痛實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞總數(shù)和

中性粒細(xì)胞數(shù)升高臨床表現(xiàn)—厭氧菌感染特征厭氧菌感染的特征感染局部有氣體產(chǎn)生分泌物有惡臭、帶血或呈黑色發(fā)生在粘膜表面的感染長期應(yīng)用抗生素繼發(fā)的感染細(xì)菌學(xué)特征:常規(guī)培養(yǎng)陰性，但

直接涂片有細(xì)菌，且細(xì)菌染色不

均、形態(tài)各異、明顯的多形性二、厭氧菌培養(yǎng)與鑒定（一）厭氧菌樣本采集與運(yùn)送采集原則：體表及其與外界相通的腔道，即有正常菌群寄生的部位的標(biāo)本，不宜作厭氧菌檢查。采集方法：針筒穿刺抽取，嚴(yán)格無菌操作，盡量避免接觸空氣。厭氧菌樣本采集厭氧菌樣本選擇感染局部有氣體產(chǎn)生排出物有惡臭、帶血、呈黑色或黃綠色與腫瘤有關(guān)的感染病程呈亞急性或慢性長期使用氨基糖苷類抗生素?zé)o效者發(fā)生在肛周、口腔、鼻竇、咽頰等部位感染應(yīng)用甲硝唑、替硝唑治療有效者厭氧菌樣本運(yùn)送床邊（直接）接種針筒運(yùn)送法無菌小瓶運(yùn)送法組織塊運(yùn)送法（二）厭氧菌的分離培養(yǎng)厭氧環(huán)境的建立機(jī)械換氣法即抽氣換氣法，是最直接的去除容器內(nèi)氧氣的方法。用真空泵（空氣壓縮機(jī)）抽出容器內(nèi)的空氣，充以氮?dú)?、氦氣等。因容器?nèi)的空氣很難被完全抽盡（不可能達(dá)到真空狀態(tài)），可通過多次抽氣換氣過程來達(dá)到厭氧狀態(tài)。該方法操作較繁瑣，臨床上很少單獨(dú)應(yīng)用。厭氧環(huán)境的建立化學(xué)吸收法

連二亞硫酸鈉法（次二硫酸鈉、保險(xiǎn)粉）

Na2S2O4+2NaHCO3+O22CO2+Na2SO4+H2O黃磷燃燒法

4P+5O22P2O5,P2O5+3H2O2H3PO4鋼末法鋼絲絨或鋼末浸入硫酸銅溶液中，置換

出的金屬銅極易吸收氧氣，形成氧化銅。加氫除氧法

2H2＋O22H2O厭氧環(huán)境的建立聯(lián)合除氧法上述各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，而且一種方法很難達(dá)到很好的厭氧效果，臨床上常采用二、三種除氧方法聯(lián)合應(yīng)用，如抽氣換氣法結(jié)合加氫和鈀粒方法、抽氣換氣法結(jié)合連二亞硫酸鈉法等，可達(dá)到較好的厭氧效果。常用的厭氧菌培養(yǎng)方法簡易厭氧袋培養(yǎng)法

用一種透明、不透氣的塑料袋作為厭氧容器，內(nèi)置化學(xué)吸氧裝置、厭氧指示劑。放入接種好的平板后，立即啟動(dòng)化學(xué)吸氧裝置，迅速密封袋口，置35℃環(huán)境中培養(yǎng)。

本法經(jīng)濟(jì)、操作簡單，但容量較小。適用于少量標(biāo)本的床邊接種。簡易厭氧袋厭氧菌培養(yǎng)方法厭氧罐（盒）培養(yǎng)法透明、不透氣的玻璃罐或塑料盒作為厭氧容器，內(nèi)置化學(xué)產(chǎn)氣裝置和厭氧指示劑。部分玻璃制的厭氧罐（盒）有進(jìn)、排氣閥門，可通過抽氣換氣法先除去容器內(nèi)大部分氧氣，再用化學(xué)方法吸收剩余的氧氣，可以更快、更好地達(dá)到厭氧狀態(tài)。本法操作簡單，容量較厭氧袋大，但使用的試劑較多，接種單個(gè)標(biāo)本時(shí)不經(jīng)濟(jì)。厭氧罐培養(yǎng)方法厭氧手套箱培養(yǎng)法由手套操作箱、傳遞箱、空氣壓縮機(jī)和控制版面、氣體瓶等組成。手套操作箱正面為透明的有機(jī)玻璃，上有一副不透氣的橡皮手套，可通過手套直接在操作箱內(nèi)進(jìn)行接種、鑒定的操作。內(nèi)有恒溫室，可直接培養(yǎng)厭氧菌。通過傳遞箱放入或取出物品。操作箱內(nèi)長期保持厭氧狀態(tài)，厭氧標(biāo)本可迅速處于厭氧環(huán)境，有利于厭氧菌的分離培養(yǎng)。厭氧手套箱厭氧菌培養(yǎng)方法多功能（厭氧/微需氧）微生物

培養(yǎng)系統(tǒng)（Multi-purposeIncubator）應(yīng)用氣體抽排置換原理，內(nèi)置精密無油真空泵、高精度壓力傳感裝置和軟件控制處理系統(tǒng)，可自動(dòng)控制氣體的抽排與置換，使連接的罐體快速達(dá)到厭氧或微需氧環(huán)境。多功能微生物培養(yǎng)系統(tǒng)邁瑞公司TDR-Y100厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)多種用途

厭氧、微需氧、CO2抗壓設(shè)計(jì)

不銹鋼材管體/聚酯透明頂蓋升溫快速5分鐘達(dá)到設(shè)定溫度多選氣源3個(gè)氣體接口（空氣/N2/CO2/H2)快速準(zhǔn)確

達(dá)到厭氧條件3分10秒

操作簡便

觸屏顯示，一鍵啟動(dòng)厭氧菌樣本處理接種前樣本的處理檢查標(biāo)本來源是否符合厭氧菌培養(yǎng)的要求；檢查標(biāo)本運(yùn)送是否符合要求；核實(shí)標(biāo)本采集時(shí)間；觀察標(biāo)本的性狀有無惡臭、血液、黑色、氣泡、硫磺顆粒等；革蘭染色鏡檢。染色鏡檢厭氧菌標(biāo)本染色鏡檢，重要、必要提示有無細(xì)菌感染和有無厭氧菌感染。若鏡下有細(xì)菌存在，而普通細(xì)菌培養(yǎng)無細(xì)菌生長，則提示有厭氧菌感染的可能。大致判斷標(biāo)本中的細(xì)菌含量。根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、染色性和排列方式，以及有無多形性、有無各種厭氧菌的特殊形態(tài)，為鑒定厭氧菌提供參考與依據(jù)。芽胞、莢膜等特殊結(jié)構(gòu)，為鑒定革蘭陽性芽胞桿菌提供參考。

培養(yǎng)基的選擇厭氧血瓊脂平板膽汁七葉苷瓊脂平板（BBE）卡那萬古凍溶血瓊脂平板（KVLB）TSN瓊脂平板（新霉素和多粘菌素）CCFA瓊脂平板初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)標(biāo)本接種每份標(biāo)本接種2塊普通血瓊脂平板和1塊厭氧血瓊脂平板，加1塊厭氧選擇培養(yǎng)基。2塊普通血瓊脂平板分別置有氧和CO2環(huán)境培養(yǎng)；厭氧血瓊脂平板和厭氧選擇培養(yǎng)基置厭氧環(huán)境培養(yǎng)。（三）耐氧試驗(yàn)從厭氧瓊脂平板上挑取可疑菌落，分別轉(zhuǎn)種2塊普通血瓊脂平板和1塊厭氧血瓊脂平板，然后分別置有氧、CO2和厭氧環(huán)境中孵育。在有氧和厭氧環(huán)境中均能生長者為兼性厭氧菌；在有氧和厭氧環(huán)境中均不生長，僅在CO2環(huán)境中生長者為需CO2菌（苛養(yǎng)菌）；而在有氧和CO2環(huán)境中均不生長，僅在厭氧環(huán)境中生長者，為專性厭氧菌。耐氧試驗(yàn)?zāi)脱踉囼?yàn)示意圖耐氧試驗(yàn)（四）厭氧菌的鑒定從樣本來源估計(jì)粘膜皮膚從樣本性狀分析惡臭氣泡血性黑色硫磺顆粒一級鑒定（初步鑒定）涂片染色鏡檢觀察革蘭染色性、形態(tài)、多形性、芽胞、莢膜、空泡和顆粒?？股丶埰b定法觀察新疆對卡那霉素、萬古霉素、多粘菌素E，以及青霉素G、紅霉素和利福平等的敏感性。生化反應(yīng)二級鑒定三級鑒定

在一、二級鑒定的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充各種單糖分解試驗(yàn)、七葉苷和明膠水解試驗(yàn)、葡萄糖苷酶等酶類試驗(yàn)，以及PYG脂肪酸氣液相色譜分析等，最終確定待檢厭氧菌的種與亞種。商品化的鑒定試劑API20A（法國生物梅里埃公司）VITEK-ANI（法國生物梅里埃公司）MICRO-01D（美國德靈公司）厭氧菌分離鑒定流程臨床樣本

肉眼觀察分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)

染色、鏡檢耐氧試驗(yàn)

專性厭氧菌

藥敏試驗(yàn)分類鑒定菌株保存

形態(tài)染色菌落特征生化反應(yīng)藥敏鑒定氣液相色譜鑒定及藥敏結(jié)果厭氧菌檢驗(yàn)解決方案標(biāo)本采集運(yùn)送接種厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)厭氧菌鑒定藥敏推薦厭氧采集管、專用平板、氣體購買廠家所需耗材：專用厭氧采集管所需耗材：厭氧培養(yǎng)平板TDR-Y100厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)，TDR厭氧菌鑒定藥敏卡三、厭氧菌其他檢測方法（一）基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行

時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）MALDI-TOFMS質(zhì)譜技術(shù)（massspectrometry,MS）是將樣品離子化，變成氣態(tài)離子混合物并按質(zhì)荷比（M/Z）分離的分析技術(shù)。質(zhì)譜儀是實(shí)現(xiàn)上述分離技術(shù)，從而測定物質(zhì)的質(zhì)量和含量及其結(jié)構(gòu)的儀器。質(zhì)譜分析法是是一種快速有效的分析方法，利用質(zhì)譜儀進(jìn)行同位素分析、化合物分析和氣體成分分析，以及金屬和非金屬固體樣本的超純痕量分析。MALDI-TOFMSMALDI-TOFMSMALDI-TOFMSMatrix基質(zhì)Assisted輔助

Laser激光Desorption解析Ionization離子化Time飛行OfFlight時(shí)間Developedin1980‘sby:Karas&HillenkampinGermanyandTanaka&alinJapanMALDI-TOFMSMALDI-TOFMS

布魯克道爾頓公司（MSBiotyper）質(zhì)譜檢測系統(tǒng)直接檢測來自完整細(xì)菌的蛋白質(zhì)構(gòu)，用于微生物樣品鑒定與分類。MALDI-TOFMS生物梅里埃公司（VITEKMS）質(zhì)譜檢測系統(tǒng)直接檢測來自完整細(xì)菌的蛋白質(zhì)構(gòu)，用于微生物樣品鑒定與分類。desorptionionizationaccelerationseparationdetection離子探測器++++++目標(biāo)基質(zhì)／樣品加速區(qū)飛行時(shí)間環(huán)形電極圖譜靶板MALDI-TOFMS的原理美國FDA:193個(gè)菌種革蘭陰性革蘭陽性厭氧菌真菌美國FDA:40個(gè)菌種革蘭陰性中國FDA:13,790個(gè)菌株革蘭陰性革蘭陽性厭氧菌真菌中國FDA:3,740個(gè)菌株革蘭陰性革蘭陽性厭氧菌真菌目前兩個(gè)質(zhì)譜儀系統(tǒng)VITEK-MS工作流程1.挑菌落（半個(gè)）2.涂在靶板上3.加基質(zhì):1微升的CHCA基質(zhì)(真菌:加甲酸)4.上機(jī)檢測細(xì)菌和真菌都不需要萃取

Biotyper-MS工作流程

1.挑菌落2.涂靶板3.加基質(zhì)4.上機(jī)檢測5.讀取結(jié)果MALDI-TOFMS用途：MALDI-TOF-MS可檢測細(xì)菌蛋白的表達(dá)，并可根據(jù)蛋白質(zhì)表達(dá)對細(xì)菌進(jìn)行快速鑒定。優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性好，成本低，鑒定快速穩(wěn)定，可與基因測序法媲美。缺點(diǎn)：需要專業(yè)知識和專用的儀器設(shè)備。線性正電模式基質(zhì):

α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)

測定質(zhì)量范圍:

2000-20000Da每個(gè)樣品測定時(shí)間僅需15秒;1.5h可測384個(gè)樣品MALDI鑒別與分類微生物——操作簡單快速4364.065380.646254.646315.495096.017157.657273.876410.907870.628368.99010002000300040005000Intens.[a.u.]400045005000550060006500700075008000m/zMALDI鑒別與分類微生物—基于穩(wěn)定表達(dá)的高峰度蛋白，結(jié)果可信度高質(zhì)譜的應(yīng)用——厭氧菌鑒定屬的鑒定率：97.0%種的鑒定率：67.2%to83.9%部分厭氧菌鑒定不佳BacteroidesdoreiPropionibacteriumpropionicusPorphyromonassomerae……Anaerobe42(2016)101-107質(zhì)譜的應(yīng)用——厭氧菌鑒定厭氧48h培養(yǎng)：革蘭陰性，大小不等，兩端纖細(xì)，呈梭桿狀，排列無規(guī)則，疑似梭桿菌或擬桿菌。質(zhì)譜和測序證實(shí)：壞死梭桿菌。質(zhì)譜的應(yīng)用——厭氧菌鑒定厭氧48h培養(yǎng)生長不良：涂片可見革蘭陽性桿菌，彎曲，一端略尖，一端圓鈍。排列呈八字或海鷗型，無芽孢及莢膜，疑似痤瘡丙酸桿菌質(zhì)譜和測序均證實(shí)痤瘡丙酸桿菌；改進(jìn)厭氧裝置顯著提高陽性率。（二）分子生物學(xué)技術(shù)直接測序測序結(jié)果1腹水脆弱擬桿菌2腹水嗜麥芽窄食單胞菌3腹水活潑瘤胃球菌+糞腸球菌4房水痤瘡丙酸桿菌5房水肺炎鏈球菌6房水里昂葡萄球菌7腦脊液腦膜炎奈瑟菌8胸水緩癥鏈球菌9膀胱穿刺液人型支原體10膀胱穿刺液人型支原體11膀胱穿刺液牛棒狀桿菌+屎腸球菌12膀胱穿刺液淋病奈瑟菌測定未知或鑒定不出的微生物直接測定無菌標(biāo)本中的微生物優(yōu)點(diǎn)：方便，準(zhǔn)確性高，可用于檢測多種微生物。缺點(diǎn)：通量小。核酸探針技術(shù)將已知核苷酸序列DNA片段用同位素、或非放射性方法標(biāo)記，加入已變性的的被檢DNA樣本中，在合適的條件下與樣本中有同源序列的DNA片段形成雜交雙鏈，再借探針上的標(biāo)記物質(zhì)分析樣本中目的核酸片段，從而鑒定樣本中未知微生物的種類優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，可用于檢測多種病原微生物，沙門菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌、乙肝病毒缺點(diǎn)：敏感性較PCR擴(kuò)增法低實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,FQ-PCR）在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA結(jié)合的熒光染料或熒光探針，利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR過程中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，敏感度高，重復(fù)性好缺點(diǎn)：只能針對特定的病原微生物進(jìn)行鑒定，HBV、HCV、HPV、難辨梭菌、PCR技術(shù)-FQ-PCRPCR技術(shù)-多重PCR多重PCR（mutiplexPCR）：在同一反應(yīng)體系內(nèi)加入2對以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)核苷酸片段。主要用于多種病原菌（腹腔、胸腔等部位厭氧菌的混合感染）的同時(shí)檢測或鑒定分型優(yōu)點(diǎn)：不僅具有PCR的特異性和靈敏度，而且更具高效性、系統(tǒng)性、簡便經(jīng)濟(jì)性缺點(diǎn)：敏感性較低，擴(kuò)增效率不高，引物間的干擾PCR技術(shù)-單鏈構(gòu)象多肽性分析SSCP（singlestrandconformationpolymorphism）利用DNA單鏈構(gòu)象具有多態(tài)性的特點(diǎn)，進(jìn)行基因檢測的一種分析技術(shù)。首先用PCR技術(shù)擴(kuò)增特定靶序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，再進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，最后根據(jù)SSCP電泳圖譜進(jìn)行分析。優(yōu)點(diǎn)：PCR-SSCP技術(shù)操作簡單，無需專門的儀器，且敏感性高。PCR技術(shù)-限制性片段長度多態(tài)性分析限制性片段長度多態(tài)性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）根據(jù)不同細(xì)菌基因組DNA的酶切位點(diǎn)和數(shù)量不同，在限制性酶切后形成大小不等DNA片段，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，從而顯示不同種群細(xì)菌基因組DNA多態(tài)性優(yōu)點(diǎn)：RFLP技術(shù)快速、敏感缺點(diǎn)：不同細(xì)菌適合的限制性內(nèi)切酶不同，只能針對特定的病原體進(jìn)行分型鑒定。而且任何可以引起酶切位點(diǎn)改變的情況，如點(diǎn)突變和一段DNA的重新構(gòu)造等均可導(dǎo)致RFLP電泳圖譜的改變PCR技術(shù)-焦磷酸測序技術(shù)焦磷酸測序技術(shù)是基于序列合成原理的DNA序列測定技術(shù)。引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上的每一個(gè)三磷酸脫氧核苷酸聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來，以熒光信號的形式實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列，達(dá)到測定DNA序列的目的。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、高通量、速度快、重復(fù)性和精確性好，無需標(biāo)記，無需電泳。缺點(diǎn)：不適合檢測分型長于100bpDNA序列。PCR技術(shù)-恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)Q復(fù)制酶反應(yīng)（QBRA）鏈置換擴(kuò)增技術(shù)（SDA）切口酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（NEMA）轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增技術(shù)（TAS/TMA/3SR/NASBA）解旋酶擴(kuò)增技術(shù)（HDA）滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（RCA）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（SPIA）基因芯片基因芯片（genechip），又稱DNA微陣列（DNAmicroarray），是通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法。該技術(shù)采用顯微點(diǎn)樣技術(shù)，將已知序列的DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與樣本進(jìn)行雜交。其中每一個(gè)分子的位置及序列均為已知，當(dāng)熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的探針分子結(jié)合后，通過基因芯片掃描儀對熒光信號進(jìn)行檢測和分析，達(dá)到檢測的目的。優(yōu)點(diǎn)：高通量、多樣性、微型化、自動(dòng)化，可同時(shí)多種病原菌進(jìn)行檢測，快速簡便，特異性強(qiáng)。生物傳感器技術(shù)生物傳感器技術(shù)（biosensortechnique）是將傳感技術(shù)與分子生物學(xué)診斷技術(shù)相結(jié)合而形成的一門新技術(shù)。原理：待檢物質(zhì)進(jìn)入生物材料，經(jīng)分子識別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信息繼而被相應(yīng)的物理或化學(xué)轉(zhuǎn)能器轉(zhuǎn)變成可定量和可處理的電信號，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，便可知待檢物的含量。生物傳感器包括光學(xué)生物傳感器、壓電生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器等。優(yōu)點(diǎn)：尤其是光化學(xué)生物傳感器廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測，有其獨(dú)有的選擇性和靈敏度。（三）艱難梭菌的檢測進(jìn)展艱難梭菌（Clostridiumdifficile，CD）：革蘭陽性厭氧桿菌可在健康人胃腸道定植兒童約80%成人<5%芽孢抵抗力強(qiáng)，酒精無法殺滅。艱難梭菌的概述艱難梭菌感染（CDI）在醫(yī)院抗生素相關(guān)腹瀉（AAD）病因中占15%25%，患者臨床表現(xiàn)輕重不一，輕者為自限性腹瀉，重者可以發(fā)展至中毒性結(jié)腸炎，甚至死亡。內(nèi)源性感染——抗生素導(dǎo)致的菌群失調(diào)廣譜抗菌藥物的使用被認(rèn)為是引起CDI的主要高危因素。幾乎所有的抗菌藥物均與CDI的發(fā)生有一定關(guān)系，其中最重要的藥物包括克林霉素、青霉素、頭孢菌素和氟喹諾酮類。外源性感染——糞-口傳播艱難梭菌感染致病性的CD產(chǎn)生毒素A（腸毒素）和毒素B（細(xì)胞毒素）：尤以毒素B重要。有A+B+、A-B+，尚未發(fā)現(xiàn)A+B-。毒素A和毒素B——毒素是致病必需(產(chǎn)毒性)致病性CD還產(chǎn)生二元毒素（CDT），但致病機(jī)制未明。糞便存在難辨梭菌細(xì)菌≠難辨梭菌感染艱難梭菌感染艱難梭菌感染相關(guān)疾病與表現(xiàn)難辨梭菌感染相關(guān)的主要疾病偽膜性腸炎(PMC)>95%的PMC是CD感染引起的中毒性巨結(jié)腸結(jié)腸穿孔膿毒血癥死亡罕見臨床表現(xiàn):腹瀉水樣便

(3次>天)伴發(fā)熱胃納差惡心腹痛白細(xì)胞增多癥艱難梭菌感染流行病學(xué)75依據(jù)統(tǒng)計(jì)人群不同國外1中國2所有抗生素相關(guān)腹瀉20-30%21.4%

廣州楊劍斌等，2007所有醫(yī)院內(nèi)腹瀉病人12.3%泰國腹瀉送檢病人中312.6%細(xì)菌培養(yǎng)陽性10.4%細(xì)菌培養(yǎng)+毒素檢測皆陽性11.5%為主要診斷抗生素使用患者N/A5.6%所有住院病人3.8-9.5/萬住院人.天數(shù)。

34-84/萬急診入院病人4.1/萬住院人.天數(shù)45/萬住院病人.天數(shù)1,PracticeguidelineforC.difficileinfectioninadults2,Journalofbiomedicalresearch,2010,24(6):411-4163，JMedAssocThai.2011Feb;94Suppl1:S207-164，Lancet2011Jan1;377(9759)5，C.difficielinfectionpreventionDaleN.Gerding在許多醫(yī)院，CD已經(jīng)超過MRSA,成為最常見的院內(nèi)感染病源菌5抗生素使用

后之腹瀉20%抗生素使用

后之腸炎50-75%抗生素使用后之偽膜性腸炎(PMC)，>90%艱難梭菌感染危險(xiǎn)因素抗生素使用殺滅結(jié)腸內(nèi)健康的、保護(hù)性的細(xì)菌風(fēng)險(xiǎn)最高的抗生素:頭孢類，克拉霉素和氟喹諾酮類特定CD菌株高齡嚴(yán)重潛在疾病

艱難梭菌感染診斷美國流行病醫(yī)學(xué)會SHEA和美國傳染病學(xué)會IDSA成人難辨梭菌感染臨床實(shí)踐指南——難辨梭菌感染的確診依賴于臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查，兩者缺一不可臨床實(shí)踐中，抗生素使用一般是診斷依據(jù)的一部分，但也存在極少量（<1%）的難辨梭菌感染不伴隨抗生素使用，見于社區(qū)獲得性病例臨床癥狀實(shí)驗(yàn)室檢查腹瀉便檢—難辨梭菌毒素或者產(chǎn)毒素檢測陽性腸鏡/組織病理學(xué)檢查—證實(shí)偽膜性腸炎致病性的CD產(chǎn)生毒素A（腸毒素）和毒素B（細(xì)胞毒素）：尤以毒素B重要。有A+B+、A-B+，尚未發(fā)現(xiàn)A+B-。毒素A和毒素B——毒素是致病必需(產(chǎn)毒性)致病性CD還產(chǎn)生二元毒素（CDT），但致病機(jī)制未明。糞便存在難辨梭菌細(xì)菌≠難辨梭菌感染艱難梭菌感染培養(yǎng)是最敏感的方法之一初代培養(yǎng)：選擇性培養(yǎng)基——環(huán)絲氨酸-頭孢西丁果糖平板（CCFA），厭氧環(huán)境，培養(yǎng)48h，形成表面粗糙、邊緣不齊、較大的黃色菌落，紫外燈照射下可見黃綠色熒光。耐氧試驗(yàn)菌種鑒定毒素檢測艱難梭菌檢測——培養(yǎng)致病性的CD產(chǎn)生毒素A（腸毒素）和毒素B（細(xì)胞毒素）：尤以毒素B重要。有A+B+、A-B+，尚未發(fā)現(xiàn)A+B-。致病性CD還產(chǎn)生二元毒素（CDT），但致病機(jī)制未明。艱難梭菌毒素A和B的檢測主要是通過對疑似病例的糞便中毒素的檢測完成。細(xì)胞毒素測定（CTA）：CTA中毒素B的檢測被認(rèn)為是CD檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。

將培養(yǎng)的細(xì)胞暴露到有或者沒有抗毒素存在的排泄抽提物中。如果排泄物毒素B陽性，則對沒有經(jīng)過抗毒處理培養(yǎng)細(xì)胞有毒害作用。酶免疫測定（EIA）：采用特異性抗毒素A和B的抗體，直接檢測毒素存在。生物梅里埃公司VIDAS可以快速檢測ToxinA/B,以及GDH（CD特異性代謝酶）。艱難梭菌檢測——毒素檢測CD進(jìn)行分子檢測，能夠直接從糞便樣本中檢測tcdB、tcdA、或cdt

基因，證實(shí)產(chǎn)毒艱難梭菌的存在，具有檢測快速（0.5-3h）、準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢。PCR:敏感度為89%-92%，優(yōu)于EIA，而特異性相相當(dāng)。但針對同一患者7d內(nèi)重復(fù)PCR檢測在臨床上沒有實(shí)用價(jià)值。PCR的不足之處在于不能區(qū)分定植與感染。采用qPCR檢測產(chǎn)毒素的CD檢出率在普通人群中約為2%，在住院患者中為7%-25%。因此，指南推薦PCR僅用于出現(xiàn)腹瀉的患者，否則容易出現(xiàn)假陽性。FISH：采用量子點(diǎn)-親和素-生物素-DNA探針直接對糞便樣本中的CD進(jìn)行熒光原位雜交。快速、簡便、特異。但尚不能檢測毒素。艱難梭菌檢測——分子檢測艱難梭菌檢測方法的比較檢測方法優(yōu)勢劣勢毒素檢測

毒素酶免疫法(EIA)快速，簡單，便宜敏感性不夠，但對于難辨梭菌感染具有很高特異性

細(xì)胞培養(yǎng)+細(xì)胞毒性試驗(yàn)CD相關(guān)酶類比毒素酶免疫方法更敏感，生物活性毒素勞動(dòng)密集型;需要特殊設(shè)備，24-48小時(shí)得出最終檢測結(jié)果

谷氨酸脫氫酶

(GDH)EIA快速，敏感特異性較差，需要進(jìn)一步測試來確定診斷，不是100%敏感。核酸擴(kuò)增檢測

(PCR)快速，敏感，檢測毒素基因的存在費(fèi)用高，需要特殊設(shè)備，可能‘過于’敏感糞便培養(yǎng)操作合適的情況下是最敏感的方法確認(rèn)毒素產(chǎn)生，勞力密集型，需要48-96小時(shí)出結(jié)果歐洲CDI診斷指南“兩步法”“兩步法”美國CDI診斷指南檢測難辨梭菌或其毒素只能使用腹瀉（不成形）糞便檢測(B-II)。糞便培養(yǎng)是最敏感的檢測，對流行病學(xué)研究非常重要(A-II)。酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（EIA）進(jìn)行難辨梭菌毒素A/B檢測十分快速，可作為診斷的備選方法(B-II)。兩步法：細(xì)菌檢測+毒素檢測(B-II)。四、厭氧菌體外藥敏試驗(yàn)厭氧菌的感染率高及時(shí)控制厭氧菌感染減少厭氧菌耐藥菌株的產(chǎn)生了解厭氧菌耐藥性的變遷（一）藥敏臨床意義臨床意義

隨著抗厭氧菌藥物的大量應(yīng)用，厭氧菌對抗生素的耐藥性也呈上升趨勢。部分脆弱擬桿菌對甲硝唑的MIC>128絕大多數(shù)脆弱擬桿菌、部分普雷沃菌和梭桿菌對青霉素、氨芐西林、阿莫西林耐藥（二）體外藥敏實(shí)驗(yàn)指征嚴(yán)重的深部感染(腦膿腫、肺膿腫、腹腔感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、修復(fù)物或移植的血管感染，以及菌血癥等)慢性感染經(jīng)驗(yàn)用藥無效新藥評價(jià)耐藥性監(jiān)測（三）抗菌藥物選擇

根據(jù)細(xì)菌的種類和本地區(qū)、本單位常用抗菌藥物的種類，選擇體外藥敏試驗(yàn)的藥物。試驗(yàn)藥物分為首選藥物和次選藥物。均敏感時(shí)，應(yīng)先選擇首選藥物。首選藥物耐藥或病人對首選藥物過敏時(shí)，再選擇次選藥物。

抗菌藥物選擇脆弱擬桿菌-內(nèi)酰胺酶陽性-內(nèi)酰胺酶陰性產(chǎn)氣莢膜梭菌、格蘭陽性無芽孢桿菌、消化鏈球菌其它梭狀芽孢桿菌氨芐西林/舒巴坦氨芐西林/舒巴坦青霉素/氨芐西林青霉素/氨芐西林青霉素/氨芐西林頭孢西丁/頭孢替坦頭孢西丁/頭孢替坦頭孢西丁/頭孢替坦克林霉素克林霉素克林霉素克林霉素克林霉素亞安培南/美洛培南亞安培南/美洛培南亞安培南/美洛培南甲硝唑甲硝唑甲硝唑甲硝唑甲硝唑首選藥物抗菌藥物選擇脆弱擬桿菌-內(nèi)酰胺酶陽性-內(nèi)酰胺酶陰性產(chǎn)氣莢膜梭菌、格蘭陽性無芽孢桿菌、消化鏈球菌其它梭狀芽孢桿菌頭孢唑肟/頭孢曲松頭孢唑肟/頭孢曲松頭孢西丁/頭孢替坦頭孢西丁/頭孢替坦頭孢唑肟/頭孢曲松氯霉素氯霉素頭孢唑肟/頭孢曲松哌拉西林四環(huán)素哌拉西林/替卡西林哌拉西林/替卡西林哌拉西林/替卡西林曲伐沙星曲伐沙星曲伐沙星次選藥物（四）試驗(yàn)方法瓊脂稀釋法肉湯稀釋法E-test法1.試驗(yàn)方法—瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法─NCCLS推薦方法

將不同稀釋濃度的抗生素加入已溶化的瓊脂中。將待檢菌株接種在含不同濃度抗生素的平板上厭氧環(huán)境中孵育，觀察細(xì)菌生長情況。抑制細(xì)

菌生長的最低抗生素濃度即為MIC。試驗(yàn)方法—瓊脂稀釋法瓊脂平板的要求營養(yǎng)好：強(qiáng)化布氏瓊脂，5%（v/v）溶解綿羊血、氯化血紅素5g/mL和1g/mL維生素