蛋白的分離純化

2023/12/221一蛋白質(zhì)的提取、分離純化基本技術(shù)路線(xiàn)細(xì)胞破碎蛋白提取蛋白分離純化蛋白濃縮蛋白貯存微生物、動(dòng)物或植物細(xì)胞發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液蛋白處理離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。冷凍干燥、結(jié)晶等特征參數(shù)研究、酶分子修飾、固定化初分離和細(xì)分離2023/12/222蛋白分離純化的一般步驟和原理層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點(diǎn)電沉淀有機(jī)溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級(jí)→│←細(xì)分級(jí)→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎與蛋白的抽提生物組織→→提取液→

→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶分子大小溶解度電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力依據(jù)原理2023/12/223二細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)蛋白，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎2023/12/224JY92-IID超聲波細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)2常見(jiàn)的細(xì)胞破碎儀器組織搗碎機(jī)玻璃研缽2023/12/225細(xì)胞破碎方法的選擇：動(dòng)物細(xì)胞比較容易破碎，通過(guò)一般的研磨器、勻漿器、搗碎機(jī)等可達(dá)到目的細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，破碎需要用超聲波、細(xì)菌磨、溶菌酶、某些化學(xué)溶劑（如甲苯、去氧膽酸納）或凍融等處理植物細(xì)胞因與細(xì)菌一樣具有細(xì)胞壁，所以它們的破壁方法與細(xì)菌的破壁方法類(lèi)似。2023/12/226細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布2023/12/227

蛋白的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗鞍自?，使蛋白充分溶解到提取液中的過(guò)程。也稱(chēng)為蛋白的抽提。蛋白提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般?lái)說(shuō)，相似相溶；酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。蛋白基本上都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些蛋白與脂質(zhì)結(jié)合或含有比較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。三蛋白的提取2023/12/228蛋白的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的蛋白酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的蛋白堿溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的蛋白有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的蛋白大多數(shù)蛋白類(lèi)都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，蛋白的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱(chēng)為鹽溶現(xiàn)象。

2023/12/2291、沉淀分離2、離心分離3、過(guò)濾與膜分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、萃取分離Go四常見(jiàn)的分離純化方法2023/12/22102.1、沉淀分離

沉淀分離是通過(guò)改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使蛋白的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。2023/12/2211在鹽濃度達(dá)到某一界限后，蛋白的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱(chēng)為鹽析現(xiàn)象。注意與鹽容的區(qū)別.2.1.1鹽析沉淀分離法2023/12/2212

溫度和pH值不變,改變離子強(qiáng)度使不同的蛋白分離的方法稱(chēng)為Ks分段鹽析；離子強(qiáng)度的不變,改變溫度和pH值，使不同的蛋白分離的方法，稱(chēng)為β分段鹽析。

在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。在鹽析時(shí)，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。2023/12/2213調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表2023/12/2214

有機(jī)溶劑之所以能使蛋白沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時(shí)水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。同時(shí)，對(duì)于具有水膜的分子來(lái)說(shuō)，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于蛋白的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等

2.1.2有機(jī)溶劑沉淀分離法2023/12/2215有機(jī)溶劑沉淀分離法的示意圖2023/12/22162.1.3其他常見(jiàn)的沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理

等電點(diǎn)沉淀法

利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值，使蛋白或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離

復(fù)合沉淀法

在蛋白液中加入某些物質(zhì)，使它與蛋白形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使蛋白與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法

選擇一定的條件使蛋白液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的蛋白，從而使蛋白與雜質(zhì)分離2023/12/2217幾種主要沉淀方法比較2023/12/22182.2、離心分離

離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。2023/12/2219

常速離心機(jī)又稱(chēng)為低速離心機(jī),其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以?xún)?nèi)，相對(duì)離心力（RCF）在1×104g以下，在蛋白的分離純化過(guò)程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于蛋白的結(jié)晶等較大顆粒的分離。2.2.1、常速離心分離2023/12/2220

高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為（0.8～2.5）×104r/min，相對(duì)離心力達(dá)到1×104～1×105g，在蛋白的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過(guò)程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機(jī)。2.2.2、高速離心分離2023/12/2221

超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)(2.5～12)×104r/min，相對(duì)離心力可以高達(dá)5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。2.2、超速離心分離2023/12/22222.4.1常見(jiàn)的層析分離方法

層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專(zhuān)一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化聚焦層析將蛋白等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離2023/12/2223吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過(guò)程。溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法2.4.2吸附層析分離2023/12/2224

分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。

分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。

在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過(guò)程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動(dòng)，稱(chēng)為流動(dòng)相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動(dòng)相的帶動(dòng)流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分配。紙上層析分配薄層層析分配氣相層析

2.4.3分配層析分離2023/12/2225

離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽(yáng)離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。2.4.3離子交換層析分離2023/12/2226

凝膠層析又稱(chēng)為凝膠過(guò)濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。

凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過(guò)凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。2.4.4凝膠過(guò)濾層析分離2023/12/2227常用的凝膠：葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠

2023/12/2228

親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專(zhuān)一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。

酶與底物,酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段,RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等之間，都是具有專(zhuān)一而又可逆親和力的生物分子對(duì)。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用.2.4.3親和層析分離2023/12/2229常用的親和介質(zhì)及專(zhuān)一性配體2023/12/2230幾種主要層析方法比較2023/12/22312.5、電泳分離帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程稱(chēng)為電泳。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：

紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時(shí)受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件的影響。2023/12/2232毛細(xì)管電泳2023/12/2233SDSseparatesproteinsbyMW2023/12/22342023/12/22352023/12/22362023/12/2237

制備式電泳通常以不含SDS的原態(tài)disc

進(jìn)行，以便回收具有活性的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)樣本要先經(jīng)過(guò)部分純化，否則效果不佳，并先以分析式電泳確定所要色帶的位置。2023/12/2238本節(jié)目錄2023/12/2239五蛋白的純化方法的分類(lèi)(1)根據(jù)蛋白溶解度不同進(jìn)行的純化①鹽析法②有機(jī)溶劑沉淀法③共沉淀④選擇性沉淀⑤等電點(diǎn)沉淀法(2)根據(jù)分子大小進(jìn)行的純化①凝膠過(guò)濾②超濾③超離心2023/12/2240(3)建立在電學(xué)解離性質(zhì)進(jìn)行的純化①吸附層析②離子交換層析③疏水層析④反相層析⑤電泳分離(4)利用專(zhuān)一親和作用進(jìn)行的純化①親和層析②親和電泳③融合蛋白親和分離法2023/12/2241(5).根據(jù)穩(wěn)定性差別建立的純化方法①選擇性熱變性②選擇性酸堿變性法③表面變性法2023/12/2242六蛋白的組合分離純化策略Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）設(shè)計(jì)分離純化工藝的基本要求2023/12/2243七蛋白的純度檢驗(yàn)方法(1)超速離心法(2)電泳(3)SDS電泳(4)等電聚焦(5)N-末端分析(6)免疫技術(shù)2023/12/2244八蛋白的濃縮、干燥與結(jié)晶

濃縮與干燥都是蛋白與溶劑（通常是水）分離的過(guò)程。在蛋白的分離純化過(guò)程中是一