組織培養(yǎng)與植物轉(zhuǎn)基因

組織培養(yǎng)與植物轉(zhuǎn)基因1第一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日植物基因工程是指把不同生物有機(jī)體的DNA（或基因）分離提取出來(lái)，在體外進(jìn)行酶切和連接，構(gòu)成重組DNA（RecombinantDNA）分子，然后轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞（大腸桿菌）使外源基因在受體細(xì)胞中復(fù)制增殖，然后借助生物的或理化的方法將外源基因?qū)氲街参锛?xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)譯或表達(dá)。也稱為植物遺傳轉(zhuǎn)化、植物轉(zhuǎn)基因等。

1植物基因工程的概念2第二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日植物基因工程是80年代開始興起和發(fā)展起來(lái)的一門新技術(shù)，它是在分子遺傳學(xué)的理論基礎(chǔ)上，綜合采用了分子生物學(xué)、微生物學(xué)和植物組織培養(yǎng)的現(xiàn)代方法和技術(shù)建立起來(lái)的。轉(zhuǎn)移的目的基因可從動(dòng)物、人、植物或微生物中獲取。植物基因工程首先是隨原核生物的基因工程的發(fā)展而得以發(fā)展。大腸桿菌，酵母，動(dòng)植物細(xì)胞。3第三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日植物基因工程發(fā)展迅速。自從1983年首例轉(zhuǎn)基因植物（煙草）誕生以來(lái)，現(xiàn)在已有100多種植物通過基因工程技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，包括番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、胡蘿卜、芹菜、萵苣、甜瓜、黃瓜、白菜、甘藍(lán)、花椰菜、芥菜、石刁柏、洋蔥、柑橘、柿、楊樹、桉樹等。4第四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日2植物基因工程的載體Ti—載體其它載體RNAi

5第五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）的Ti質(zhì)粒（Tumor-inducingplasmid）的改建與利用，從而開創(chuàng)了植物基因工程的新紀(jì)元。根癌農(nóng)桿菌6第六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日7第七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日8第八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日9第九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日T－DNA10第十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日植物基因工程中，我們把接受外源(目的)基因的生命體系稱為“受體”。受體包括：葉圓片(盤)、胚性愈傷、胚狀體、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等不同的形態(tài)。其基本形態(tài)還是細(xì)胞。葉圓片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)化方法；愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率高、生長(zhǎng)速度快，是快速檢測(cè)外源基因表達(dá)的最好受體；原生質(zhì)體則是單克隆轉(zhuǎn)化的最佳材料。3植物基因轉(zhuǎn)化的受體11第十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化植株（未）受精卵細(xì)胞花粉胚胚軸子葉葉片莖段萌發(fā)種子子房原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞花器官根創(chuàng)傷植株塊莖莖尖植物基因轉(zhuǎn)化的外植體12第十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞是單個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞，為選擇遺傳均一性的轉(zhuǎn)基因植株提供了可能性。以懸浮細(xì)胞作受體的轉(zhuǎn)化方法包括：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG介導(dǎo)法、電激法和顯微注射法等。3.1懸浮細(xì)胞13第十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日原生質(zhì)體是無(wú)細(xì)胞壁的細(xì)胞。與懸浮細(xì)胞一樣，被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞是單個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞，為選擇遺傳均一性的轉(zhuǎn)基因植株提供了可能性。3.2原生質(zhì)體14第十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日愈傷組織容易大量制備愈傷組織的轉(zhuǎn)化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上獲得成功。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法最適合。3.3胚性愈傷組織15第十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日胚狀體是由愈傷組織經(jīng)過改造后分化而來(lái)的，其轉(zhuǎn)化方法與愈傷組織相同。3.4胚狀體16第十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日葉圓片是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的主要受體。也稱為葉盤法。用打孔器或解剖刀切取直徑3—5mm的葉圓片；在液體培養(yǎng)瓶中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)20-30min；將葉圓片在濾紙上吸干；轉(zhuǎn)移到非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d；再移入含抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)；誘導(dǎo)植株再生；獲得轉(zhuǎn)基因植株。葉盤法常見于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。3.5葉圓片17第十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日如子葉、胚軸、莖段、根、體細(xì)胞胚、花粉等3.6其他受體18第十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium-mediatedtransformation)基因槍轉(zhuǎn)化法(Microprojectilebombardment)聚乙二醇-介導(dǎo)法(PEG-mediatedtransfomation)電激法(Electroporation)花粉管通道法(Pollen-tubepathway)顯微注射法(Microinjection)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Liposomestransformation)激光微束轉(zhuǎn)化法(Lasermicrobeampuncture)

4植物基因轉(zhuǎn)化的方法19第十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacience)介導(dǎo)法是植物基因轉(zhuǎn)化中使用最普遍的一種方法。其Ti質(zhì)粒(Tumor-inducingplasmid)具有將DNA整合到植物染色體上，并使之與植物內(nèi)源基因同步表達(dá)的能力。每個(gè)Ti質(zhì)粒都有3個(gè)功能區(qū)域。一是T-DNA區(qū)，即轉(zhuǎn)化DNA區(qū)，與病癥發(fā)生有關(guān)的基因位于這個(gè)區(qū)，決定著腫瘤形態(tài)和冠癭堿的合成；二是Vir區(qū)，是T-DNA區(qū)以外的與感染腫瘤有關(guān)的區(qū)域；三是分解和利用冠癭堿的區(qū)域，分布著冠癭堿分解酶基因。4.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法20第二十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日4.2微彈轟擊法原理：金屬微粒在外力作用下達(dá)到一定速度后，可以進(jìn)入植物細(xì)胞，但又不引起細(xì)胞致命傷害，仍能維持正常的生命活動(dòng)。也稱為基因槍法。利用這一特性，先將含目的基因的外源DNA同鎢、金等金屬微?；靹?，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨后用基因槍轟擊，使DNA隨高速金屬微粒進(jìn)入植物細(xì)胞。此方法可直接處理植物某器官或某組織，是當(dāng)今普遍使用的植物轉(zhuǎn)基因方法。21第二十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日22第二十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日聚乙二醇介導(dǎo)法與PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的機(jī)理相似，不同的是后者發(fā)生在原生質(zhì)體之間，而前者發(fā)生在原生質(zhì)體與DNA之間。在高濃度的二價(jià)鈣離子(Ca2+)和高pH值的條件下，略帶負(fù)電的高分子PEG可能促進(jìn)DNA向原生質(zhì)體膜沉淀，或參與原生質(zhì)體的內(nèi)吞作用下，使外源DNA分子進(jìn)入原生質(zhì)體和細(xì)胞核，并整合到染色體上。4.3聚乙二醇-介導(dǎo)法23第二十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日4.4電激法原理：細(xì)胞膜的基本組成是磷脂，在適當(dāng)?shù)耐饧用}沖電場(chǎng)作用下，細(xì)胞膜被擊穿，但還達(dá)不到細(xì)胞致命傷害。所以當(dāng)移去外加電場(chǎng)后，被擊穿的膜孔可自行復(fù)原。也稱為電穿孔法。根據(jù)這一性質(zhì)，植物原生質(zhì)體同外源DNA分子混合，置于電擊儀的樣品室中，按預(yù)定的參數(shù)進(jìn)行直流電脈沖處理，再通過常規(guī)的再分化培養(yǎng)和篩選，可獲得轉(zhuǎn)基因植株。為避免制備原生質(zhì)體和原生質(zhì)體再生植株的困難，近來(lái)用此技術(shù)直接處理具有完整細(xì)胞壁的植物細(xì)胞、愈傷組織和花粉粒，均取得一定的效果。24第二十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日25第二十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日26第二十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日4.5花粉管通道法原理：將重組DNA涂于授粉的柱頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具有正常細(xì)胞壁的卵、合子和早期的胚胎細(xì)胞，在活體內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子。27第二十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日花粉管通道法28第二十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日4.6顯微注射法原理：利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。重要問題：必須把受體細(xì)胞進(jìn)行固定。動(dòng)物細(xì)胞具有獨(dú)特的貼壁生長(zhǎng)待性，因此不存在固定細(xì)胞的問題。植物細(xì)胞的顯微注射必須建立固定細(xì)胞技術(shù)。目前有三種方法：①瓊脂糖（低熔點(diǎn)）包埋法；②多聚-L-賴氨酸粘連法；②吸管（毛細(xì)管）支持法。29第二十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日4.7脂質(zhì)體介導(dǎo)法原理：脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，把用來(lái)轉(zhuǎn)染的DNA分子包在其中，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸，將外源DNA導(dǎo)人受體細(xì)胞。包裝成脂質(zhì)體的DNA的轉(zhuǎn)染串比裸露的DNA的轉(zhuǎn)染率高出100倍。如先用PEG處理培養(yǎng)的受體細(xì)胞，使其易吸收培養(yǎng)基中的脂質(zhì)體，可提高轉(zhuǎn)染率10—20倍。在正常情況下，每個(gè)細(xì)胞平均可吸收1000個(gè)左右的脂質(zhì)體。這是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究中常用的方法之一。30第三十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日4.8激光微束穿孔法原理：利用直徑很?。{米級(jí)）、能量很高的激光微束可引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下用激光處理細(xì)胞，處于細(xì)胞周圍的重組DNA隨之進(jìn)入細(xì)胞。此方法最適用于活細(xì)胞中線粒體和葉綠體等細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)移。31第三十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日32第三十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日植株再生是基因轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，直接決定能否獲得轉(zhuǎn)基因植株。兩種形式：一種是愈傷組織再生另一種是直接再生，從外植體直接誘導(dǎo)出芽而不經(jīng)過愈傷組織的分化。轉(zhuǎn)墓因植株再生的方式與一般植株再生的方式相同，主要區(qū)別是轉(zhuǎn)基因植株的再生受外源基因、載體系統(tǒng)、抗生素、轉(zhuǎn)化過程的影響。5轉(zhuǎn)基因植株的再生及其檢測(cè)方法5.1轉(zhuǎn)基因植株再生33第三十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日常采用報(bào)告基因作為標(biāo)記，以便快速檢測(cè)。主要采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)，包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、Southern

Blot、NorthernBlot和WesternBlot等方法。進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)以后還要進(jìn)行生物學(xué)鑒定，以確定基因是否可以正常地表達(dá)性狀，并穩(wěn)定地遺傳給后代。如果一些有價(jià)值的目的基因被轉(zhuǎn)入，還必須鑒定基因的功能及其表型。5.2轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)34第三十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日如轉(zhuǎn)化抗病毒基因：要對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行病毒接種，以鑒定抗病毒能力。若轉(zhuǎn)化的基因?yàn)榭钩輨┗颍哼€要對(duì)植物噴灑除草劑進(jìn)行檢測(cè)。若轉(zhuǎn)基因植物是食用糧食作物或油料：還要通過轉(zhuǎn)基因植物的安全性檢測(cè)，以免對(duì)人類和環(huán)境造成危害。如果轉(zhuǎn)化的是花色素合成酶基因：則憑肉眼就可直觀鑒定花色變化。35第三十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日36第三十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日6植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性

國(guó)際大討論37第三十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日斑蝶事件：1999年5月，康奈爾大學(xué)的一個(gè)研究組在《Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國(guó)大斑蝶，導(dǎo)致44％的幼蟲死亡?，F(xiàn)在這個(gè)事件也有了科學(xué)的結(jié)論：第一，玉米的花粉非常重，擴(kuò)散不遠(yuǎn)，在玉米地以外５米，每一平方厘米馬利筋葉片上只找到一個(gè)玉米花粉。第二，2000年開始在美國(guó)三個(gè)州和加拿大進(jìn)行的田間試驗(yàn)都證明，抗蟲玉米花粉對(duì)斑蝶并不構(gòu)成威脅，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中用10倍于田間的花粉量來(lái)喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有影響。斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。38第三十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日加拿大“超級(jí)雜草”事件：由于基因漂流，在加拿大的油菜地里發(fā)現(xiàn)了個(gè)別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級(jí)雜草”。事實(shí)上，這種油菜在噴施另一種除草劑2，4-Ｄ后即被全部殺死。應(yīng)當(dāng)指出的是，“超級(jí)雜草”并不是一個(gè)科學(xué)術(shù)語(yǔ)，而只是一個(gè)形象化的比喻，目前并沒有證據(jù)證明已經(jīng)有“超級(jí)雜草”的存在。同時(shí)，基因漂流并不是從轉(zhuǎn)基因作物開始，而是歷來(lái)都有。如果沒有基因漂流，就不會(huì)有進(jìn)化，世界上也就不會(huì)有這么多種的植物和現(xiàn)在的作物栽培品種。39第三十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日墨西哥玉米事件：2001年11月，美國(guó)加州大學(xué)伯克萊分校的兩位研究人員在《Nature》上發(fā)表文章，聲稱在墨西哥南部Oacaca地區(qū)采集的６個(gè)玉米地方品種樣本中，發(fā)現(xiàn)有CaMV35S啟動(dòng)子及NovartisBtll抗蟲玉米中的adh1基因相似序列。綠色和平組織借此大肆渲染，說(shuō)墨西哥玉米已經(jīng)受到了“基因污染”，甚至指責(zé)墨西哥小麥玉米改良中心的基因庫(kù)也可能受到了“基因污染”。文章發(fā)表后受到很多科學(xué)家的批評(píng)，。所謂測(cè)出的35S啟動(dòng)子，經(jīng)復(fù)查證明是假陽(yáng)性。所稱Ｂｔ玉米中的adh1基因已經(jīng)轉(zhuǎn)到了墨西哥玉米的地方品種，也是假的。轉(zhuǎn)入Ｂｔ玉米中的基因序列是adh1

-S基因，而作者測(cè)出的是玉米中本來(lái)就存在的adh1

-IF基因，兩者的基因序列完全不同，是兩碼事。顯然作者沒有比較這兩個(gè)序列，審稿人和《Nature

》編輯部也沒有核實(shí)。墨西哥小麥玉米改良中心（CIMMYT）也發(fā)表聲明指出，經(jīng)對(duì)種質(zhì)資源庫(kù)和新近從田間收集的152份材料的檢測(cè)，在墨西哥任何地區(qū)都沒有發(fā)現(xiàn)35S啟動(dòng)子。40第四十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日中國(guó)Ｂｔ抗蟲棉破壞環(huán)境事件：2003年６月３日，南京環(huán)科所與綠色和平組織在北京召開會(huì)議，６月４日《ChinaDaily》上發(fā)表了題為“GMCottonDamageEnvironment”的文章，亦即“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉破壞了環(huán)境”。綠色和平組織也于當(dāng)天在其網(wǎng)站上刊登了南京環(huán)科所、綠色和平組織顧問薛達(dá)元先生長(zhǎng)達(dá)26頁(yè)的英文報(bào)告，從而再次引發(fā)國(guó)際爭(zhēng)論，在歐、美產(chǎn)生巨大反響，成為國(guó)際上爭(zhēng)論轉(zhuǎn)基因作物安全性的重大事件之一。41第四十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日6月5日德國(guó)《農(nóng)業(yè)報(bào)》發(fā)表了題為“ChineseResearch:largeEnvironmentDamagebyBtCotton”的文章，即：“中國(guó)研究：Bt棉破壞環(huán)境巨大”。綠色和平組織的“中國(guó)項(xiàng)目主管”盧思聘聲稱：棉農(nóng)“將面對(duì)不受控制的超級(jí)害蟲”（這里他又全無(wú)科學(xué)根據(jù)地提出了“超級(jí)害蟲”的新名詞！），“聲稱可以減少農(nóng)藥使用的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，不但沒有解決問題，反而制造了更多的問題”，“（棉農(nóng)）將被迫使用更多、更毒的化學(xué)農(nóng)藥”?？瓜x棉在中國(guó)實(shí)踐多年，深受廣大棉農(nóng)的歡迎，相信不會(huì)同意他的這些結(jié)論。中國(guó)、美國(guó)、德國(guó)、加拿大、比利時(shí)、印度等國(guó)的科學(xué)家已在網(wǎng)上紛紛發(fā)表評(píng)論，反駁綠色和平組織的觀點(diǎn)。42第四十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）國(guó)際轉(zhuǎn)基因作物爭(zhēng)論的實(shí)質(zhì)并不純粹是科學(xué)問題，而是經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易問題?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物的安全性已經(jīng)成了國(guó)際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。（2）爭(zhēng)論應(yīng)該以科學(xué)為基礎(chǔ)，目前批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品還沒有發(fā)現(xiàn)環(huán)境和食品安全性問題。長(zhǎng)期效應(yīng)需要跟蹤，包括非預(yù)期效應(yīng)，但非預(yù)期效應(yīng)的分析必須與安全性評(píng)價(jià)相結(jié)合。（3）歸結(jié)到一點(diǎn)，今天與反生物技術(shù)組織的爭(zhēng)論，是要不要轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品、要不要科學(xué)和社會(huì)文明進(jìn)步的問題。他們的根本出發(fā)點(diǎn)是要禁止一切生物技術(shù)！而我們則是在保證環(huán)境和人類健康的同時(shí)促進(jìn)生物技術(shù)的發(fā)展，這是兩者的根本區(qū)別所在。爭(zhēng)論的實(shí)質(zhì)43第四十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日7植物轉(zhuǎn)基因的成果一、植物新品種的培養(yǎng)（1）利用DNA重組技術(shù)將目的基因轉(zhuǎn)入蔬菜中，培育成的蔬菜稱為轉(zhuǎn)基因蔬菜，它主要是用來(lái)選育具有特殊優(yōu)良性狀的(如抗蟲、抗病、抗除草劑等)蔬菜新品種。（2）通過基因工程手段，培育出高抗、優(yōu)質(zhì)林、草新品種。44第四十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日利用轉(zhuǎn)基因植物作為反應(yīng)器，把外源基因引入植物體內(nèi)以生產(chǎn)醫(yī)用多肽和醫(yī)用疫苗正成為繼轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以后又一新興的研究領(lǐng)域。生物學(xué)家把機(jī)體的免疫機(jī)理與植物DNA重組技術(shù)相結(jié)合，將激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的病原體基因分離出來(lái)，重組到植物體中，生產(chǎn)出能夠使人體獲得特異抗病能力的食用疫苗。人體攝食含該種疫苗的植物后，由于疫苗不被酶類所破壞，通過