生物顯微技術(shù) 第二章 切片的制作

生物顯微技術(shù)第二章切片的制作第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日石蠟切片的過程動物的處死動物組織取材固定組織固定后的處理脫水和透明包埋切片第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日一、動物的處死麻醉空氣栓塞頸椎脫臼或斷頭股動脈放血第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日二、動物組織取材動物組織取材原則：盡量保持組織的生活狀態(tài)。動作要快不要過度用力夾捏組織，防止組織變形。第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日三、固定1、目的：盡量保持組織的生前狀態(tài)，防止組織的死后變化、自溶。保持細胞和組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，保持組織內(nèi)部成分特征不發(fā)生變化。2、方式：浸入式灌注式第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日灌注式此法適用于動物實驗研究。自左心室插入主動脈，先以生理鹽水沖冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材，投入固定液。灌注法固定可使固定液迅速達到全身各組織。達到充分固定之目的。第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日3、固定液醛類固定劑非醛類固定劑丙酮及醇類固定劑第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日醛類固定劑雙功能交聯(lián)劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)。包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛通常與其他的試劑聯(lián)合使用優(yōu)點是對組織穿透性強，收縮性小?？梢员４娴鞍踪|(zhì)、脂肪、黏液物質(zhì)以及一定量的糖原。缺點：長期固定使組織過度硬化及細胞核不著色，并且產(chǎn)生“福爾馬林色素”，它是由于血紅蛋白與甲醛轉(zhuǎn)化的酸形成正鐵血紅素。第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日非醛類固定劑氯化汞（HgCI2）：蛋白的強固定劑重鉻酸鉀：保存類脂、高爾基復合體、及染色體等結(jié)構(gòu)。苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定劑，醋酸：固定染色體。軟化組織，緩解收縮。蔗糖：防止某些細胞成分擴散，保持酶活性，良好形態(tài)。四氧化鋨：保存細胞蛋白質(zhì)細微結(jié)構(gòu)有良好效應(yīng)，應(yīng)用與電鏡觀察切片的固定與染色。第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日丙酮及醇類固定劑丙酮：沉淀蛋白質(zhì)和糖，對組織穿透性很強。可以單獨使用，低溫下保持酶活性效果好。乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差。必須與其他試劑混合使用，單獨使用使組織收縮嚴重，對細胞形態(tài)保存不良。第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日混合固定劑固定組織時，單獨使用一種固定劑很難對組織成分有理想的固定效果。通常幾種固定劑混用，制成混合固定劑。以求得補償某試劑對組織所致的缺陷。第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日4%多聚甲醛磷酸緩沖液pH7.4成分：4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸緩沖液中，1倍的磷酸緩沖液:PBSMV

NaCl140mM58.44KCl2.7mM74.55NaH2PO4?12H2O，10mM358.14KH2PO41.8mM136.09

調(diào)pH至7.4。

第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日Bouin’s液苦味酸飽和水溶液75ml15固定糖原37%-40%福爾馬林液25ml5固定蛋白和脂肪冰醋酸5ml1凝固核染色質(zhì)第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日固定組織時應(yīng)注意：①應(yīng)力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。②組織塊不易過大過厚，必須小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是組織塊厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。③固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組織20倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日固定時間的選擇不同的研究目的所需使用的固定液。材料的大小，組織的特性與致密度。溫度的不同有所差別。第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日組織固定后的處理沖洗或漂洗：組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液造成的人為假象。修塊:大小合適、去除形態(tài)不好的部分，第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日四、脫水脫水目的：運用某種溶劑置換組織內(nèi)的水分。脫水劑：乙醇、丙酮、正丁醇等第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日乙醇：最常用的脫水劑一般組織：70%---80%----90%--100%---100%特殊組織：30%--40--%--50%---60%---70%---80%---90%--100%---100%每步30分鐘左右。要求：完全脫凈，保證脫水梯度和每一步脫水時間

不能過度脫水（使組織變脆）不同組織脫水時間不同：大的致密的組織需要延長脫水時間為加速各級酒精的穿透力，脫水可在37℃溫箱中進行。

第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日五、透明或媒浸目的與作用對組織的最后脫水處理與包埋劑置換透明劑：苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有機溶劑100%乙醇脫水后進入二甲苯兩次，保證透明完全。第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日六、包埋包埋劑的特點：具有一定的強度和韌度，滿足切片的要求。能完全進入組織。對組織內(nèi)部成分損傷小。第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日石蠟包埋石蠟特點：熔點：45-50℃軟蠟

55-60℃硬蠟常用石蠟的處理：新蠟應(yīng)溶一次，增加密度。并用濾紙過濾去處雜質(zhì)。加5%~10%的蜂蠟,增加石蠟的韌性。反復溶的舊蠟包埋效果更好。程序：在溶蠟箱中進行55-60℃，恒溫。浸蠟：二甲苯透明后的組織塊在二甲苯：石蠟（1：1）中兩次，在石蠟中兩次，每次一個小時左右。包塊：在室溫進行第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日七石蠟切片載玻片處理：切片：展片：背面與玻片。烘片：37℃的溫箱內(nèi)烤干(約需12小時)。第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日優(yōu)點：操作比較簡便、容易，可以切出較薄的切片，并且易于制成連續(xù)切片，也容易附著于載玻片上。缺點：是不適于較大的標本，材料在經(jīng)過脫水、浸蠟的過程中容易收縮。第二十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日火棉膠切片法透明劑：乙醚與乙醇等量混合包埋劑：火棉膠溶于透明劑包埋：常溫進行凝固：在乙醚中過夜，在氯仿中過夜。在70%乙醇中保存。第二十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日優(yōu)點：可切大的組織可切較硬的組織如硬骨缺點：操作所用