三種鑒定葡萄球菌凝固酶方法的比較

摘要的評(píng)價(jià)3種定葡萄球菌凝固酶方法的敏感性和特異性臨分離的110株葡萄球菌經(jīng)過(guò)革蘭染色顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)酶試驗(yàn)VITEK32鑒后用試管法、玻片法、商品乳膠血凝法slidexstaph-kit定葡萄球菌和評(píng)價(jià)凝固酶試驗(yàn)方法3種方法結(jié)果不一致的菌株進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。用兔血漿試管法作為標(biāo)準(zhǔn)，比較其它凝固酶方法的敏感性、特異性。結(jié)果兔血漿試管法檢測(cè)到65株性菌株，以此為標(biāo)準(zhǔn)，兔血漿玻片法有3株假陽(yáng)性，人血漿玻片法和乳膠血凝法的假陽(yáng)性分別為8株和株人血漿試管法的鑒定符合率為100%其各種方法的敏感性均為100%而異（血漿和人血漿玻片法乳凝集試驗(yàn)）分別為95.6%88%，和98.5%結(jié)論血漿凝固酶試管法敏感性特異性均較高，是鑒定葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)的好方法，適合于各基層臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)葡萄球菌的鑒定。關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶；乳膠試劑耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，然而臨床標(biāo)本中金黃色葡萄球菌鑒定中往往困擾者廣大檢驗(yàn)工作者，血漿凝固酶試驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌的重要方法之一。鑒定的準(zhǔn)確性直接關(guān)系到進(jìn)一步上機(jī)鑒定及藥敏試驗(yàn)判斷及RS紙法篩選判斷。凝固酶分為兩種：游離性凝固酶，結(jié)合型凝固酶，游離型凝固酶常用試管法鑒定，結(jié)合型凝固酶常用玻片法鑒定。隨著現(xiàn)代微生物技術(shù)的不斷發(fā)展，許多醫(yī)院開(kāi)始選用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的葡萄球菌乳膠凝集試劑作為檢出金黃色葡萄球菌的常規(guī)篩選試驗(yàn)試劑，雖然乳膠試劑盒簡(jiǎn)便，快速，但是易出現(xiàn)假陽(yáng)性且價(jià)格昂貴。為尋找一種適合廣大基層醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室對(duì)葡萄球菌鑒定經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的鑒定法本以兔血漿試管法為標(biāo)準(zhǔn)[1]對(duì)110株臨床分離的葡萄球菌凝固酶分別進(jìn)行兔血漿，人血漿凝固酶試驗(yàn)和乳膠凝集試驗(yàn)。評(píng)價(jià)其敏感性，特異性。1材料方法材1.1.1菌株來(lái)源株萄球菌來(lái)自于我院2011月～2013年9月臨床分離菌株，保存于20℃低溫冰箱，實(shí)驗(yàn)前種于5%血基礎(chǔ)平板，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌落進(jìn)行試驗(yàn)。1.1.2菌株鑒定以所有菌株都經(jīng)革蘭染色，觸酶試驗(yàn)，顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，血漿凝固酶試管法和VITEK32微物自動(dòng)鑒定。1.1.3質(zhì)菌株以黃色葡萄球菌ATCC25923為陽(yáng)性對(duì)照菌株，表皮葡萄球菌ATCC26069為陰性對(duì)照菌株。購(gòu)于云南省臨床檢驗(yàn)中心。1.1.4其它試劑、材料1.1.4.1兔漿，上海市疾病控制中心生產(chǎn)商品試劑（批號(hào)201301291.1.4.2乳試劑盒（slidexstaph-kit）法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)。1.1.4.3人漿備取30例觀清亮體檢（肝、腎功，血糖、血脂均正常）肝素抗凝血制備成混合血漿低溫保存?zhèn)溆谩?.1.4.4其材料所試管燒均洗凈后高壓滅菌消毒后備用玻均用新玻片消毒滅菌后備用。方將萄球菌接種于血板，經(jīng)過(guò)1824h培養(yǎng)后，分別采用兔血漿，人血漿，乳膠試劑進(jìn)行試驗(yàn)。1.2.1玻片法試驗(yàn)取1滴生理鹽水置玻片上待測(cè)細(xì)菌理水中制成菌懸液；取血漿1滴置片上與菌懸液混10s內(nèi)見(jiàn)到明顯凝塊，而生理鹽水中無(wú)凝集現(xiàn)象者為陽(yáng)性；試驗(yàn)同時(shí)做陽(yáng)性，陰性對(duì)[2]。1.2.2試法試驗(yàn)混血漿用理鹽水稀釋40.5ml被鑒定葡萄球菌數(shù)個(gè)菌落，混合后放35℃孵箱3～記錄果若陰性然再放置24h再觀察記錄結(jié)果觀察時(shí)，將試管從垂直位緩慢傾斜90°觀察試管中凝集的形成。同時(shí)做陰性、陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3膠凝集試驗(yàn)先致敏的乳膠顆粒試劑充分混勻一次性卡片的兩個(gè)不同區(qū)域各加1滴致敏試劑，然后用接種環(huán)取待測(cè)的葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物加入試驗(yàn)區(qū)，對(duì)照區(qū)則加1滴照試劑，輕輕混勻、乳化觀察結(jié)果內(nèi)試驗(yàn)側(cè)凝集，而對(duì)照側(cè)無(wú)凝集時(shí)，可判斷為陽(yáng)性。試驗(yàn)同時(shí)做陽(yáng)性、陰性對(duì)照。其他所有操作方法均按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]執(zhí)行。2結(jié)果三方法檢測(cè)葡萄球菌的結(jié)果見(jiàn)表1。2.2以兔漿試管法為標(biāo)準(zhǔn)，比其它試驗(yàn)方法的敏感性和特異性（見(jiàn)表2從上可知3種法檢出凝固酶陽(yáng)性的葡萄球菌除人血漿玻片法檢出率較高外6.4%，其它方法的檢出率均無(wú)太大差異血漿試管法檢測(cè)到65株陽(yáng)性菌株以為標(biāo)準(zhǔn)兔血漿玻片法有3株陽(yáng)性，人血漿玻法和乳膠血凝法的假陽(yáng)性分別為8株株。血漿試管法的鑒定符合率為100%其各方法的敏感性均為而特異（兔血漿和人血漿玻片法，乳膠凝集試驗(yàn)）分別為88%和98.5%。3討論金黃色葡萄球菌是常見(jiàn)的致病菌，正確鑒定金黃色葡萄球菌較為重要。血漿凝固酶試驗(yàn)是檢測(cè)金黃色葡萄球菌的關(guān)鍵。致病性較強(qiáng)的金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著于細(xì)菌表面成塊，凝塊包繞細(xì)菌，使其免遭抗生素，抗體，吞噬等多種因素的作用。葡萄球菌有兩種凝固酶，一種是與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，即凝集因子，它可直接作用于纖維蛋白原，可用玻片法檢出；另外一種是菌體釋放到培養(yǎng)基中的游離凝固酶，它可以與血漿中的凝固酶反應(yīng)因子協(xié)同作用于纖維蛋白原，使血漿凝固，故可用試管法檢出。凝集因子試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)是兩個(gè)不相關(guān)試驗(yàn)，兩者不能相互代替，也不可以相互印證。本次試驗(yàn)可以看出除血漿凝固酶試管法沒(méi)有假陽(yáng)性外，其它方法都存在假陽(yáng)性。血漿凝固酶玻片放的假陽(yáng)性明顯較（血漿68例人血漿73例異較差原可能是由于人血漿中產(chǎn)生的自身抗體或血漿中的抗凝劑所致。所以在玻片法檢測(cè)結(jié)合型凝固酶時(shí)，應(yīng)注意用蒸餾水代替生理鹽水稀釋血漿葡萄球菌對(duì)鹽敏感是不能使用高鹽培養(yǎng)基，血漿不能過(guò)多，一般是1滴，接環(huán)血漿4種環(huán)蒸餾水混勻，可減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)。乳膠凝集試驗(yàn)中也存在著假陽(yáng)性，可能是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌細(xì)胞壁中的蛋白A含量過(guò)高而導(dǎo)致假陽(yáng)性的出[凝集試驗(yàn)是用提純的FC段與金黃色葡萄球菌蛋白）結(jié)合，反應(yīng)機(jī)制是雙鏈?zhǔn)剑员苊饬四承┙瘘S色葡萄球菌游離凝固酶或PA產(chǎn)足主所致的假陰性；它用于檢測(cè)凝集因子和蛋白質(zhì)A乳膠混合血漿試劑，大大地提高了檢測(cè)凝集因子的特異性。而此次試驗(yàn)中試管法檢測(cè)葡萄球菌凝固酶的敏感性與特異性均較高，并且人血漿與兔血漿所檢出凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌菌株符合率為100%無(wú)假陽(yáng)性與假陰性出現(xiàn)主是由于試管法檢測(cè)的是游離型凝固酶，是菌體釋放到培養(yǎng)基中的，它可以與血漿中的凝固酶反應(yīng)因子協(xié)同作用于纖維蛋白原使血漿凝固試中血漿應(yīng)做稀釋觀應(yīng)在35℃育24h后。從此次試驗(yàn)可知，在快速鑒定葡萄球菌時(shí)，應(yīng)選用兔血漿作玻片法凝固酶試驗(yàn)或選用乳膠試劑做鑒定，但不能作為確證試驗(yàn)。人血漿凝固酶試管法敏感性特異性均較高，是鑒定葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)的好方法，適合于各基層臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)葡萄球菌的鑒定。參考文獻(xiàn)：[1]張升.三鑒定葡萄球菌凝酶方法的評(píng)價(jià)[A].實(shí)醫(yī)技雜志，2007，