免疫組化實驗方法

關于免疫組化實驗方法第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三免疫組織化學的概念利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑

（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。2第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三最突出的優(yōu)點在更廣闊的范圍內，把結構與功能及代謝結合起來，在微觀世界原位地確定組織及細胞結構的化學成分，達到方法統一，定性可靠，定位準確，定量可能。3第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三免疫組化實驗標本組織標本（石蠟切片和冰凍切片）細胞標本（組織印片、細胞爬片和細胞涂片）。石蠟切片對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔；4第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三細胞和組織的固定1．固定的作用--使細胞內蛋白質凝固、終止或抑制外源性和內源性酶活性，最大限度地保存細胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉變?yōu)榉撬苄钥乖?，防止抗原彌散?．選擇最佳固定液的標準：保持組織形態(tài)結構；保存抗原性。（1）醛類固定劑：穿透性較強，收縮性小，是常用的固定劑。如10％中性福爾馬林液、4％多聚甲醛緩沖液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。（2）非醛類固定劑：適用于多肽類激素的組織固定，常與戊二醛或多聚甲醛混合使用。（3）丙酸及醇類固定劑：沉淀蛋白質和糖，保存抗原性較好。但對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質的保存效果較差，和其它試劑混合使用加以解決，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（適用于動物實驗研究）

組織新鮮勿干燥體積適中固定液足夠（>20倍）5第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三抗體常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。特性比較：均一性2.穩(wěn)定性

3.特異性4.重復性5.沉淀反應6第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三熒光素標記抗體

能夠產生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素。必備條件:③熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結果。

④結合抗體蛋白后對抗體的免疫學性質和生化性質無影響，用于活體內標記，結合物應無毒，附加抗原性小。7第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三常用的染色方法根據標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法按標記物定位于抗原所在部位的手段，則可將免疫細胞組織化學染色方法分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋連法等。每進行一步結合反應。都會產生一次陽性結果的放大效應。敏感性由高到低依次為橋連法、間接法、直接法。8第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三染色的基本程序①標記抗體與標本中抗原反應結合；②用緩沖液洗去未結合的成分；③直接觀察結果；或顯色后再用顯微鏡觀察。9第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三反應條件抗原抗體結合屬于可逆性反應，具有共性的反應條件：（1）PH：中性及弱鹼性條件（PH7～8）有利于免疫復合物的形成（2）離子強度：0.01～0.02M的低離于強度有利于免疫復合物的形成（3）去污劑：有利于復合物的形成，常用的非離子型去污劑有吐溫-20，EDTA（0.01%），TritonX-100（0.1～1%）（4）抗體稀釋液中蛋白質濃度：稀釋液中含無關蛋白質可以減少抗體的非特異吸附，常用牛血清白蛋白（5）防腐劑：微生物生長會干擾抗原抗體反應，稀釋液和抗體液中加入適量的疊氮鈉或硫柳汞以防腐（6）溫度和時間：較高的反應溫度（37℃）可加速抗原抗體結合反應，低溫有利于抗原抗體結合率的提高（7）洗滌：除去未結合抗原或抗體，除去非特異性吸附造成的背景染色。選用自來水、生理鹽水或PBS等，加去污劑并在洗滌過程中加以振搖10第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三熒光素

1，異硫氰酸熒光黃（fluoresceinisothiocyanate，FITC）黃色、橙黃色或褐黃色結晶粉末，最大吸收光譜為490～495nm，最大發(fā)射光譜為520～530nm，呈現明亮的黃綠色熒光。最常用。2．四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyante，TRITC）紫紅色粉未，較穩(wěn)定，最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃綠色熒光對比鮮明。3．四乙基羅丹明（tetraethylrhodamineB200，RB200）褐紅色粉未，最大吸收光譜570nm，最大發(fā)射光譜596～600nm，呈橙紅色熒光。價廉。11第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三染色注意事項（1）在濕盒內進行，以免標本上的試劑干燥。（2）酸堿度以接近體液環(huán)境為宜（PH7.4左右）（3）組織細胞要求新鮮，最好使用冷凍切片，固定存檔標本要求組織結構完好。（4）切片經染色后，應及時觀察并照相。切片在4℃冰箱內過夜，其熒光強度將減弱約30％。（5）調整抗體稀釋度以獲得最佳染色效果，以背景非特異性染色最小為標準，對每一批抗體必須試驗摸索，找出最佳稀釋度。（6）所購抗體應及早使用，盡量減少抗體溶液的凍融次數。12第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三酶標抗體法通過共價鍵將酶結合在抗體上制成酶標抗體，再借酶對底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產物，于顯微鏡下進行細胞或組織表面或內部某種抗原成分定位觀察。常用的酶--辣根過氧化物酶（HRP），堿性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。優(yōu)點：與免疫熒光技術相比，終產物可在普通光鏡下觀察，切片能夠長久保存，經鋨酸處理后，電子密度增強，可用于電鏡觀察。13第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三抗生物素-生物素-過氧化物酶技術

(avidin-biotinperoxidasecomplexABC)原理：利用抗生物素分別連接生物素標記的第2抗體和生物素標記的酶。其第1抗體不為標記物所標記，生物素標記的第2抗體與ABC復合物相連接。ABC復合物是將過氧化物酶結合在生物素上，再將生物素-過氧化物酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應而制備的。常用：ABC-HRP辣根過氧化物酶：最通用的系統，使用范圍廣ABC-AP堿性磷酸酶：靈敏度比較高，染色密度較低

ABC-GO葡萄糖氧化酶：靈敏度較低，適用于組織內源性HRP或者AP含量比較高的組織，常與HRP或者AP系統配合進行雙染14第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三15第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三ABC法的特點：敏感性強特異性強，背景染色淡方法簡便，節(jié)約時間可用于雙重或多重免疫染色。16第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三免疫金染色原理：

免疫金染色技術使用膠體金耦聯抗體，然后在光學顯微鏡下檢測抗原。解決了免疫組化里內源性酶干擾的問題。整個檢測過程中無需酶的參與，因此不必預先處理樣本以消除內源性酶的活性。17第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三免疫組化試劑的正確選擇和使用18第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三一抗1.首選單克隆抗體：單克隆抗體具有高特異性、高親和力、交叉反應少等特點，避免與細胞或組織蛋白的非特異性結合，減少染色背景。2.多克隆抗體：最好是經樣本來源種屬正常血清吸附過，盡可能的減少非特異性著色背景。加一抗前，用封閉液（可以是BSA或二抗來源的正常動物血清）充分封閉，以阻斷非特異性結合位點。3.跨膜分子的抗體選擇：要注意免疫原是整個蛋白分子或是胞外區(qū)、胞內區(qū)。對于胞內區(qū)抗體，染色時需要使用穿孔劑，而胞外區(qū)抗體不必使用。4.正確使用：一般供應商都會提供稀釋范圍和使用方法。但常常需要重新選擇比例。一般從供應商提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作倍比稀釋。19第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三二抗種屬來源要匹配：根據所用一抗選定二抗。一般來說，如果一抗是小鼠原性，二抗應選擇兔/山羊或其它種屬抗小鼠的抗體。注意抗體同種型和亞型：確定一抗同種型和亞型后，可以選擇抗一抗來源種屬廣譜Ig或針對一抗亞型的二抗。如一抗是小鼠IgG1,可以選用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。正確使用：也需要重新選擇稀釋比例。一般從供應商提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作5倍比稀釋。20第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期三設立陽性對照和陰性對照----