基因的重組與轉(zhuǎn)移

關(guān)于基因的重組與轉(zhuǎn)移第1頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、什么是受體細(xì)胞（receptorcell）?第一節(jié)受體細(xì)胞又稱(chēng)hostcell，從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞；從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價(jià)值和理論研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞。顯然并不是所有細(xì)胞都能作為受體細(xì)胞第2頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、受體細(xì)胞的選擇應(yīng)符合哪些基本原則？九大原則！第3頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1、便于重組DNA分子的導(dǎo)入。2、能使重組DNA分子穩(wěn)定的存在于細(xì)胞中3、便于重組體的篩選。4、遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長(zhǎng)5、安全性高無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染6、選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞。7、受體細(xì)胞在遺傳密碼的應(yīng)用上無(wú)明顯偏倚性8、具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)。9、在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。第4頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、目前常用的受體細(xì)胞？這些受體細(xì)胞各有哪些特點(diǎn)？1、大腸桿菌2、枯草桿菌3、藍(lán)細(xì)菌4、棒狀桿菌5、鏈霉菌原核生物細(xì)胞6、酵母菌7、植物細(xì)胞8、動(dòng)物細(xì)胞真核生物細(xì)胞第5頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三原核生物細(xì)胞？這是較為理想的受體細(xì)胞類(lèi)型！沒(méi)有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁原因沒(méi)有核膜，染色體DNA沒(méi)有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)基因組簡(jiǎn)單，不含線粒體基因組培養(yǎng)簡(jiǎn)單、繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快第6頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三原核生物細(xì)胞？原核生物細(xì)胞作為受體存在的缺陷！不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)原因缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)存在內(nèi)源性蛋白酶第7頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三真菌細(xì)胞—酵母菌外源真核基因最理想的表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚優(yōu)勢(shì)具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)不含有特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素培養(yǎng)簡(jiǎn)單、利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中第8頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三植物細(xì)胞優(yōu)勢(shì)具有全能性第9頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物細(xì)胞用于大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)或動(dòng)物疫苗、動(dòng)物品種的遺傳改良及人類(lèi)疾病的基因治療等能識(shí)別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子優(yōu)勢(shì)真核生物蛋白翻譯后能被正確加工或修飾易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可將表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中組織培養(yǎng)技術(shù)要求高缺點(diǎn)第10頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三研究性作業(yè)題目：國(guó)內(nèi)外利用不同受體細(xì)胞開(kāi)發(fā)生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展情況基本內(nèi)容要點(diǎn)：1、目前國(guó)內(nèi)外都開(kāi)發(fā)了哪些受體細(xì)胞作為生物反應(yīng)器，并分別用它們生產(chǎn)了哪些基因工程產(chǎn)品？為什么要選擇它作為生產(chǎn)該產(chǎn)品的反應(yīng)器？2、生物反應(yīng)器這一領(lǐng)域目前存在哪些問(wèn)題？將來(lái)發(fā)展趨勢(shì)如何？3、目前，國(guó)內(nèi)外有哪些從事生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)的企業(yè)？你認(rèn)為如果今后你去這里求職應(yīng)該從知識(shí)上做哪些儲(chǔ)備？要求：中文參考文獻(xiàn)不少于20篇英文參考文獻(xiàn)不少于5篇第11頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞一、重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核生物細(xì)胞二、重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核生物細(xì)胞第12頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、如何將重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核生物細(xì)胞？以大腸桿菌為例轉(zhuǎn)化途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第13頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三什么是轉(zhuǎn)化（transformation）？重組質(zhì)粒DNA分子通過(guò)與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過(guò)程。第14頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三格里菲斯的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（Diplococcuspneumoniae）,1928

愛(ài)弗萊證實(shí)轉(zhuǎn)化物質(zhì)是DNA第15頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三感受態(tài)（competent）：細(xì)菌細(xì)胞在一定的生長(zhǎng)階段，自身或通過(guò)人為處理而具有攝取外源DNA，并使其基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的能力。感受態(tài)細(xì)胞：能夠吸收DNA的細(xì)胞。第16頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第17頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.菌種的選擇野生型的大腸桿菌并不是理想的受體細(xì)胞1）、hsdR-2）、recA-

recB-

recC-3）、易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)4）、有明顯的選擇性差異5）、感染寄生缺陷型實(shí)驗(yàn)室常用菌株JM109，DH5α，Top10，DH10BHB101第18頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理第19頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.制備過(guò)程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸第20頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過(guò)程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過(guò)程。（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。第21頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法2.轉(zhuǎn)化率簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法第22頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法第23頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法第24頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過(guò)夜第25頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片段進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒5.影響轉(zhuǎn)化率的因素第26頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三①生長(zhǎng)狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞（competentcells)第27頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過(guò)受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。第28頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）；不育的菌株（不會(huì)與其他酵母接合）。第三節(jié)外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31第29頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細(xì)胞壁具有通透性，允許DNA進(jìn)入。CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。轉(zhuǎn)化第30頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化第31頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三葉盤(pán)消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1.葉盤(pán)法（leafdisk）第32頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化2.電擊法（electroporation)第33頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三又稱(chēng)高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入3.基因槍法（genegun）4.農(nóng)桿菌（agrobacterium）介導(dǎo)第34頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（1）原理：三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞1.磷酸鈣沉淀法HEPES緩沖鹽水與含有氯化鈣和DNA的溶液緩慢混合，會(huì)形成含磷酸鈣和DNA的沉淀。依據(jù)不同的細(xì)胞類(lèi)型，平皿上最多能有10%的細(xì)胞能吸收DNA沉淀。第35頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三不需要載體。（2）特點(diǎn)：第36頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如LifeTechnologies）。2.脂質(zhì)體（lipofectin）載體法脂類(lèi)包埋DNA，通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。第37頁(yè)，共40頁(yè)，2023年，2月20日，星期三直接把外源DNA注射到宿主細(xì)胞核里，