單增李斯特氏菌檢測詳解

進出口食品中(Zhong)單核細胞增生李斯特氏菌檢測方法

SN/T0184.1-2005第一頁，共二十六頁。李斯特氏(Shi)菌特征格氏李斯特氏菌英諾克李斯特氏菌綿羊李斯特氏菌單核細胞增生李斯特氏菌默氏李斯特氏菌西爾李斯特氏菌威爾斯李斯特氏菌β-溶血－－＋＋－＋－CAMP(Staphylococcusaureus)－－－＋－＋－CAMP(Rhodococcusequi)－－＋－－－－甘露醇＋－－－＋－－α甲基-D－甘露糖苷ND＋－＋ND－＋L-鼠李糖－d－＋d－d可溶性淀粉＋－－－＋NDNDD-木糖－－＋－－＋＋馬尿酸鹽水解－＋＋＋－NDND硝酸鹽還原－－－－＋NDND小鼠致病力－－＋＋－－－第二頁，共二十六頁。樣品(Pin)的存放與制備冷凍樣品：應于2℃～5℃解凍，且不超過18小時；若不能及時檢驗，應置于－15℃保存。非冷凍的易腐樣品：盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應置于4℃冰箱保存，在24h之內(nèi)檢驗。無菌取樣品25g(mL)放入滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中加225mLFB1增菌液中，充分均質(zhì)。第三頁，共二十六頁。增(Zeng)菌培養(yǎng)225mLFB130℃±1℃培養(yǎng)25h±1h，吸取1mL，加入10mLFB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。第四頁，共二十六頁。VIDAS快速(Su)篩選（可選）FB2增菌液進行VIDAS快速篩選。篩選為陰性的結(jié)果可直接報告未檢出。篩選為陽性的結(jié)果繼續(xù)分離培養(yǎng)和鑒定。第五頁，共二十六頁。分離培(Pei)養(yǎng)取增菌液一環(huán)，劃線分離于選擇性培養(yǎng)基OXA、PALCAM上，35℃±1℃培養(yǎng)24h～48h。菌落形態(tài)：24h后菌落呈現(xiàn)黑色，直徑為1mm，在其周圍形成一個黑色環(huán)。培養(yǎng)48h，菌落仍成黑色，直徑2mm～3mm，除在菌落周圍有一環(huán)外，在菌落中心部位的深層也形成黑點。挑取5個或更多的可疑菌落，接種于TSA-YE。第六頁，共二十六頁。鑒(Jian)定藍色菌落檢驗用45°斜射光照射TSA-YE平板，菌落呈現(xiàn)藍灰色到藍色。（設(shè)標準菌株對照）第七頁，共二十六頁。鑒(Jian)定典型運動鏡檢李斯特氏菌為短棒狀桿菌，可見輕微的旋轉(zhuǎn)翻滾。（設(shè)標準菌株對照）注：壓片法或懸滴法暗光第八頁，共二十六頁。鑒(Jian)定革蘭氏染色短桿狀革蘭氏陽性反應注：陳舊培養(yǎng)物多轉(zhuǎn)為陰性。第九頁，共二十六頁。鑒(Jian)定過氧化氫酶試驗挑取TSA-YE平板上的菌落于潔凈載玻片上，滴加1滴3％的過氧化氫溶液，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應。第十頁，共二十六頁。鑒(Jian)定溶血試驗刺種7％羊血瓊脂平板，并刺種陽性對照菌（單核細胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），30℃培養(yǎng)24h～48h。單核細胞增生李斯特氏菌窄小的β溶血環(huán)

西爾李斯特氏菌窄小的β溶血環(huán)

綿羊李斯特氏菌大的β溶血環(huán)

其他不溶血第十一頁，共二十六頁。鑒(Jian)定動力試驗穿刺SIM半固體培養(yǎng)基，于室溫（20℃～25℃）培養(yǎng)48h。李斯特氏菌有動力，呈典型的傘狀生長。第十二頁，共二十六頁。鑒(Jian)定硝酸鹽還原試驗接種于硝酸鹽肉湯，于35℃培養(yǎng)5d。李斯特氏菌為陰性。第十三頁，共二十六頁。鑒(Jian)定MR－VP試驗接種于MR－VP肉湯中，于35℃培養(yǎng)48h。李斯特氏菌為陽性反應。第十四頁，共二十六頁。鑒(Jian)定三糖鐵試驗接種于TSI，35℃培養(yǎng)5d。李斯特氏菌斜面和底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)硫化氫。第十五頁，共二十六頁。鑒(Jian)定尿素酶試驗穿刺尿素瓊脂斜面，于35℃培養(yǎng)5d。李斯特氏菌尿素酶試驗陰性。第十六頁，共二十六頁。鑒(Jian)定糖發(fā)酵試驗接種0.5%葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發(fā)酵管內(nèi)，35℃培養(yǎng)24h～48h，陰性繼續(xù)培養(yǎng)到第5天。第十七頁，共二十六頁。李斯(Si)特氏菌菌種鑒別特征中文菌名學名藍色菌落典型運動過氧化氫酶革蘭氏染色溶血試驗動力試驗尿素酶試驗硝酸鹽還原MR∣VP試驗三糖鐵試驗糖發(fā)酵利用葡萄糖麥芽糖七葉苷甘露醇鼠李糖木糖單核細胞增生李斯特氏菌L.monocytogenes＋＋＋＋＋＋－－＋/＋產(chǎn)酸，不產(chǎn)H2S＋＋＋－＋－綿羊李斯特氏菌L.ivanovii＋＋＋＋＋＋－－＋/＋產(chǎn)酸，不產(chǎn)H2S＋＋＋－－＋英諾克李斯特氏菌L.innocua＋＋＋＋－＋－－＋/＋產(chǎn)酸，不產(chǎn)H2S＋＋＋－V－威爾斯李斯特氏菌L.welshimeri＋＋＋＋－＋－－＋/＋產(chǎn)酸，不產(chǎn)H2S＋＋＋－V＋西爾李斯特氏菌L.seeligeri＋＋＋＋＋＋－－＋/＋產(chǎn)酸，不產(chǎn)H2S＋＋＋－－＋格氏李斯特氏菌L.grayi＋＋＋＋－＋－－＋/＋產(chǎn)酸，不產(chǎn)H2S＋＋＋＋－－第十八頁，共二十六頁。鑒(Jian)定協(xié)同溶血試驗（cAMP）在羊血瓊脂平板上各劃一直線，使兩線平行，在平行線上分別接種金黃色葡萄球菌ATCC49444和馬紅球菌ATCC6939，在兩線之間垂直接種，與兩線相近但不相交，于35℃培養(yǎng)24h～48h后，觀察相交處溶血情況。L.monocytogenesL.innocuaL.ivanovii窄的β溶血帶不溶血寬的β溶血帶第十九頁，共二十六頁。CAMP(Staphylococcusaureus)

StaphylococcusaureusListeriamonocytogenes第二十頁，共二十六頁。鑒(Jian)定API鑒定試驗可代替硝酸鹽還原、MR-VP、三糖鐵、糖發(fā)酵、尿素酶和CAMP等試驗。第二十一頁，共二十六頁。鑒(Jian)定血清學檢驗菌懸液于80℃水域中加熱1h，離心棄上清，剩余液與沉淀混勻制成菌懸液，進行血清學玻片凝集試驗。單核細胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B，1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C，4D，4E，7第二十二頁，共二十六頁。質(zhì)量控(Kong)制每次檢驗均需用標準陽性菌株和陰性菌株進行質(zhì)量控制。樣品制備的同時，在空白對照FB1增菌液中加入新鮮配制的每毫升含有10個～100個單核細胞增生李斯特氏菌的稀釋液1mL和陰性培養(yǎng)物，按檢驗程序進行同步檢驗。第二十三頁，共二十六頁。報告(Gao)結(jié)果協(xié)同溶血試驗、血清學試驗可根據(jù)需要進行，常規(guī)檢驗可不進行這些試驗。報告陽性結(jié)果：檢出單核細胞增生李斯特氏菌。報告陰性結(jié)果：未檢出單核細胞增生李斯特氏菌。第二十四頁，共二十六頁。新舊標準的(De)主要不同增菌