微生物檢驗機構(gòu)質(zhì)量管理

關(guān)于微生物檢驗機構(gòu)質(zhì)量管理第1頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四微生物檢驗的特點-1微生物種類繁多而又復雜，必須正確把握樣本的采集時機、部位、運送、保存及處理等環(huán)節(jié)，選擇最佳方法，及時檢驗，正確、規(guī)范操作，才能及時、準確地報出準確可靠的結(jié)果。第2頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

微生物檢驗的特點-2

五大衛(wèi)生樣品中的病原微生物數(shù)量少，種類又多，生物學性狀也是多種多樣的，將環(huán)境中存在數(shù)量較多、具有一定代表性、檢測方法較簡單的微生物作為指標性微生物。根據(jù)這些指標性微生物的檢出情況，來判斷樣品被污染的程度，間接地指示病原微生物存在的可能；以及對人群是否構(gòu)成潛在的威脅。第3頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四一、微生物檢驗過程關(guān)鍵控制點微生物檢驗過程是個涉及多個子過程的系統(tǒng)，一般包括：采樣與運輸（需要時）、樣本接收、保存與處置、樣品制備、檢驗與記錄、結(jié)果與報告等子過程。每個子過程又由多個環(huán)節(jié)構(gòu)成，個個環(huán)節(jié)又受多種因素影響，因此識別和控制關(guān)鍵環(huán)節(jié)是質(zhì)量管理的重點。第4頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四過程關(guān)鍵控制點影響微生物檢測結(jié)果正確性和可靠性的關(guān)鍵控制點及其控制要求涉及到的要素包括：服務和供應品的采購-試劑與培養(yǎng)基的控制人員設施和環(huán)境條件檢測和校準方法及方法確認設備測量的溯源性抽樣檢測和校準物品的處置第5頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四試劑與培養(yǎng)基的控制要求實驗室應有對試劑與培養(yǎng)基進行檢查、評估，要求在初次使用和保存期限內(nèi)驗證并記錄每一批對檢測起決定性作用的試劑與培養(yǎng)基的適用性，不得使用未達到相關(guān)標準的試劑與培養(yǎng)基。第6頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四實驗用水的控制要求除非實驗方法有特殊要求，培養(yǎng)基、試劑及稀釋劑配制用水應經(jīng)蒸餾、去離子或反轉(zhuǎn)滲透處理并無菌、無干擾劑和抑制劑，配制用水應滿足下列參數(shù)：a)電阻率在25℃時應≥300000Ω.cm），建議每周檢測一次b)菌落總數(shù)小于1000cfu/mL，建議每月檢測一次c)重金屬（Cd，Cr，Cu，Ni，Pb等）小于0.05mg/L，重金屬總量小于10mg/L，建議每年檢測一次?！禛B/T27405-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品微生物檢測》5.4試劑和培養(yǎng)基中的規(guī)定第7頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基質(zhì)量控制方法

1.理化試驗方法1.1

pH值測定:滅菌前后都應該測定pH值,采用連接可滲透陶器型液體接頭的電極測定液體培養(yǎng)基的pH,固體培養(yǎng)基可用平頭電極或者連接微型探頭的電極測定pH。pH值在滅菌前后均需測定,測量時盡量使培養(yǎng)基溫度降到20℃～25℃,校正通常用接近40g/L的NaOH或者接近36.5g/L(約1mol/L)HCl。第8頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

1.理化試驗方法1.2凝膠強度測定:凝膠強度也是一個重要指標,滅菌條件特別是pH會影響凝膠強度。Gelometer(MarineColloidsInc1,2,EdisonPlace,Springfield,NJ07081,U1S1A1)和theLFRATextureAnalyser(C1S1Stevens&SonLtd1DolphinYard,HolywellHill,St1Albans,Herts,U.K.)均能提供良好的測量性能。這種儀器利用直徑為10mm～25mm的圓柱形金屬探頭測量壓破瓊脂表面時所需的壓力。第9頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2.微生物學方法根據(jù)培養(yǎng)基的用途不同，培養(yǎng)基的質(zhì)量控制方法不同。第10頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2.1普通增菌培養(yǎng)基質(zhì)量控制將質(zhì)控菌種新鮮培養(yǎng)液按1：10000稀釋，接種0.01ml（約100CFU）培養(yǎng)，應獲得充分生長。第11頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2.1.1混合增菌培養(yǎng)法SC肉湯質(zhì)控目標菌：鼠傷寒沙門氏菌、非目標菌：大腸桿菌方法：將目標菌和非目標菌肉湯新鮮培養(yǎng)物按照99：1進行混合，接種SC肉湯，35℃培養(yǎng)18-24h，適當稀釋，涂布麥康凱瓊脂，沙門氏菌為無色菌落，平板上應90%以上均為沙門氏菌生長，大腸桿菌為粉紅色，平板上生長應<10%。第12頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2.1.2測定增菌倍數(shù)法四硫磺酸鹽煌綠增菌培養(yǎng)基(TTB)

質(zhì)控菌株：目標菌：傷寒桿菌NICPBP50098、鼠傷寒沙門氏菌NICPBP50013。非目標菌：大腸桿菌NICPBP44156、糞鏈球菌NICPBP32221。方法：-將質(zhì)控菌肉湯培養(yǎng)物10倍稀釋至10-6；-取1mL稀釋菌液接種于9mL四硫磺酸鈉增菌液，重復接種3管，同時從同一10-6管稀釋液中吸取0.1mL，涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板，重復3副平板，37℃培養(yǎng)18h后，平板菌落計數(shù)；第13頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)-沙門氏菌的增菌液3管各取1mL混勻后，10倍系列稀釋到10-5，取0.1mL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，重復3副平板，并于37℃培養(yǎng)18h后，作菌落計數(shù)。-大腸桿菌和糞鏈球菌的增菌液各3管分別混勻后，稀釋到10-2，取0.1mL涂布營養(yǎng)瓊脂平板，各重復3副平板，并于37℃培養(yǎng)18h后，作菌落計數(shù)。

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測定增菌倍數(shù)法（續(xù)2）結(jié)果判定：增菌后平板菌落計數(shù)平均值×105

1）沙門氏菌增菌倍數(shù)= ≥105

增菌前平板菌落計數(shù)平均值

增菌后平板菌落計數(shù)平均值×1022）大腸桿菌和糞鏈球菌增菌倍數(shù)=≤102 增菌前平板菌落計數(shù)平均值3）合格指標：沙門氏菌應增菌105倍以上大腸桿菌和糞鏈球菌增菌應低于102

第15頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2.2選擇性分離培養(yǎng)基

在此類培養(yǎng)基中，一般都含有某種指示劑和抑菌劑，以指示某種生化反應和抑制某些非目標菌的生長。目標菌在這類培養(yǎng)基上生長的過程中，伴隨著生化反應，使其具有明顯的菌落特征，能與其他細菌相區(qū)別。第16頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四選擇性分離培養(yǎng)基（續(xù)）將質(zhì)控菌種新鮮培養(yǎng)液按1：10000稀釋，接種0.1ml（約100~1000CFU）涂布培養(yǎng)。按ISO/TS11133-1（食品和動物飼料微生物學—制備和生產(chǎn)培養(yǎng)基的導則—第一部分）中要求，接種目標陽性菌、弱生長陽性菌株、呈現(xiàn)不同生化特性的菌株和非目標菌（被抑制菌株），觀察菌種的典型生長情況，并通過靈敏度、特異性對該類培養(yǎng)基的質(zhì)量進行控制。靈敏度：目標菌應能生長100~1000CFU/板特異性：目標菌應生長良好，并具有典型特性，非目標菌應不生長。第17頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

2.3鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基是一類檢測細菌生理、生化特性的培養(yǎng)基。它適用于細菌純培養(yǎng)物的分類與鑒定。鑒別培養(yǎng)基的基本反應原理：借助于某些微生物所特有的某種酶，對培養(yǎng)基中某一特有成分進行分解，如脫氫、脫氨、脫羧、發(fā)酵、水解等作用。第18頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)在這些作用過程中往往會顯示一定的生化反應，可以根據(jù)這些特有的生化反應情況，來判別某一或某些細菌是否存在，或所分離菌種是屬哪一類型。所以這類培養(yǎng)基的質(zhì)控，必須先用已知菌種進行鑒定，在證明各種反應顯示正常后方可使用。[質(zhì)控菌株]陽性和陰性控制菌株

[操作]

挑取斜面質(zhì)控菌單菌落菌苔，接種于待檢培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察典型生化反應。有些培養(yǎng)基需要制備標準濃度菌懸液接種。第19頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)質(zhì)控菌株：陽性和陰性控制菌株操作：挑取斜面質(zhì)控菌單菌落菌苔，接種于待檢培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察典型生化反應。有些培養(yǎng)基需要制備標準濃度菌懸液接種。第20頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四人員要求微生物檢驗人員教育、培訓、能力、資質(zhì)、層次配備與數(shù)量應與所開展的微生物工作相適應。第21頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四1.教育與培訓微生物檢驗人員應有具微生物或相近學科專業(yè)教育背景的專業(yè)人員（原則上應具有?？萍耙陨蠈W歷）；培訓主要是針對具體的實驗操作而對有關(guān)人員進行的專門培訓，包括樣品的處理原則、微生物檢測技能、儀器設備的正確使用、實驗室生物安全、新技術(shù)、新方法的繼續(xù)教育等方面培訓。培訓應保存計劃和效果評價記錄。第22頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四2.資質(zhì)與確認一般資質(zhì)：微生物檢驗人員經(jīng)培訓，考核合格后持證上崗，可從事微生物檢驗工作。第23頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

續(xù)特殊資質(zhì)：從事消毒和操作高壓滅菌器的人員，應具備消毒學常規(guī)知識，并通過質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督部門組織的特種壓力設備操作知識的專門培訓，取得合格證資質(zhì)后，由單位授權(quán)上崗。第24頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)負責高致病性菌毒種和標本運輸?shù)娜藛T，需經(jīng)過國家疾控中心實驗室管理處和國家民航總局組織的相關(guān)培訓，并取得民航總局頒發(fā)的“中國民用航空危險品運輸訓練合格證”資質(zhì)后，方能完成運輸交接和領(lǐng)取工作。對于負責高致病性對于使用操作全自動微生物鑒定儀、核酸測序儀等大型精明儀器設備的人員和菌毒種、化學危險品管理人員等，單位應組織培訓考核，并授權(quán)。第25頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四技能確認與培訓效果評價方法通過開展微生物檢驗實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制、使用標準菌株或參加能力驗證、實驗室間比對活動等方式，評估微生物檢驗人員的技能掌握程度，客觀評價人員培訓的有效性。當開展新項目或進行非經(jīng)常開展項目或技術(shù)時，在檢測前應對微生物檢測人員的操作技能再作確認。第26頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四3.健康監(jiān)護從事傳染病實驗室檢驗的人員，特別是開展高致病性病原檢驗和研究工作的人員，需建立個人健康檔案，保留上崗前個人特定空白血清；每年進行健康檢查和與從事特定病原檢驗工作的針對性疾病檢查，必要時預防性接種適用疫苗；建立實驗室暴露或感染的處理工作程序和感染應急就醫(yī)等預案，確定定點醫(yī)院。第27頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四設施和環(huán)境條件衛(wèi)生微生物實驗室應具有進行微生物檢測所需的適宜、充分的設施條件。應有具單向流的各功能區(qū)，包括：凈化室（局部百級）（無菌室）、半無菌緩沖區(qū)、二級生物安全實驗室、微生物培養(yǎng)室、高壓滅菌與洗滌烘干室、培養(yǎng)基配制間以及耗材試劑儲藏室等。應設計工作流保證整個微生物實驗區(qū)的布局符合要求，明顯標識各功能區(qū)。第28頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)病原微生物實驗室應有具有凈化室、二級以及二級以上級別生物安全實驗室。實驗室的建設應以“無回路”為宗旨；整個試驗區(qū)有防鼠、防蚊蟲或其他昆蟲進入的設施（符合GB/T19489-2008規(guī)定）。第29頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)一般設有：常規(guī)病原微生物檢驗區(qū)、實驗輔助區(qū)、PCR或分子生物學實驗區(qū)、專門重點疾病實驗區(qū)（HIV實驗室等）、BSL-3試驗區(qū)（有另外規(guī)定略）等。第30頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四控制措施在病原微生物各試驗區(qū)必須設置出入控制設施，如門禁系統(tǒng)或其他物理隔離裝置或警戒線；在控制處設明顯的警示標識，如生物安全標識、進入控制提示語等；在控制進入處設供參觀者使用的個人防護用品和記錄簿。第31頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四環(huán)境監(jiān)測實驗室應制定科學合理的環(huán)境監(jiān)測操作規(guī)程。潔凈區(qū)域應檢測潔凈度狀態(tài)如：沉降菌、浮游菌、塵埃粒子數(shù)；設定可接受的背景菌落數(shù)量，并且有文件化的規(guī)定來處理背景菌落總數(shù)超標情況。定期更換凈化室初效、中效和高效過濾器。第32頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)生物安全柜應監(jiān)測風速、壓力、氣流方向等指標，必要時檢測箱體內(nèi)粒子數(shù)和無菌檢測；緩沖間和無菌間均有紫外線殺菌燈（2-2.5W/m3），應定期檢查輻射強度，使照射操作臺達40W/cm2。第33頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)傳統(tǒng)無菌操作室應按要求進行使用前后的無菌處理。不符合要求的紫外燈、消毒液應及時更換。記錄與數(shù)據(jù)分析應傾向于能夠確定污染水平。第34頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四衛(wèi)生要求應盡可能減少在實驗室進行文件處理；禁止把植物和個人物品帶入實驗室工作區(qū)域。根據(jù)所檢測的微生物危害等級的不同，在實驗室內(nèi)穿著相應的防護服，離開工作區(qū)域時必須脫下。這對分子生物學實驗室和危害等級II級以上實驗室尤其重要。應準備足夠數(shù)量的洗手設施和急救材料。第35頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四檢測方法的確認實驗室應對非標準方法實驗室設計（制定）的方法超出其預定范圍使用的標準方法擴充和修改過的標準方法進行確認；在采用新的方法進行檢測前，對方法進行驗證標準更后的方法的技術(shù)能力的確認。第36頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四確認方法通過使用自然污染產(chǎn)品或人工污染預定微生物的樣品來實現(xiàn)檢測方法的確認。向基質(zhì)中添加預定微生物能反映出實際檢測狀況，這是簡單模擬自然污染的狀態(tài)，是目前唯一的最佳方法。需要確認的范圍取決于所用方法及其預期應用范圍。第37頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四驗證指標對非標準方法、實驗室設計（制定）的方法、超出其預定范圍使用的標準方法、擴充和修改過的標準方法驗證指標：定性微生物檢測方法應確認其特異性、陽性偏差、陰性偏差、檢測限、培養(yǎng)基影響、重復性和再現(xiàn)性。第38頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)定量微生物檢測方法應確認其特異性、靈敏度、陽性偏差、陰性偏差、重復性、再現(xiàn)性以及規(guī)定的可變范圍內(nèi)的檢測限。在檢測不同種類的樣品時，應考慮不同培養(yǎng)基的差異。應使用適當?shù)慕y(tǒng)計方法評估檢測結(jié)果。第39頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

證實的方法與指標適用于新方法與標準變更（只年號變更除外）的方法確認向樣品中添加指示菌來簡單模擬自然污染狀態(tài)，按標準方法操作。定性微生物檢測方法：測定檢測限、進行生化試驗、血清學試驗。

定量微生物檢測方法：測定指示菌的回收率；結(jié)果判斷標準：指示菌的回收率應不低于70%。第40頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四設備與測量的溯源性微生物實驗室應制訂并實施設備維護、校準和性能驗證規(guī)程對儀器設備的校準和/或檢定（驗證）、確認的編制總體要求第41頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)

微生物檢測涉及的需定期檢定的儀器設備有：天平、砝碼、pH計、分光光度計、溫度和壓力儀表、消毒壓力容器、滅菌柜安全閥、游標卡尺等。計量器具執(zhí)行《中華人民共和國強制檢定的工作計量器具管理辦法》規(guī)定，編制年度檢定計劃，依法送檢第42頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四使用與維護記錄實驗室在儀器設備完成相應的檢定、校準、驗證、確認其性能，并形成相應的操作、維護和保養(yǎng)的標準操作規(guī)程后方可正式使用，使用要有記錄。為保證設備處于良好工作狀態(tài)，應定期維護和期間核查，并保存相關(guān)記錄。第43頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標準物質(zhì)和標準菌株標準物質(zhì)標準物質(zhì)和有證標準物質(zhì)提供了測量中基本的可溯源性，其可用來：a)證明結(jié)果的準確性；b)校準設備；c)監(jiān)測實驗室運轉(zhuǎn)；d)驗證試驗方法； e)比較試驗方法。第44頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四標準菌株微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內(nèi)或國外菌種收藏機構(gòu)的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。第45頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

續(xù)標準菌株、標準儲備菌株和工作菌株從儲備菌株傳代培養(yǎng)次數(shù)不得超過5次除非標準方法中要求并規(guī)定，或?qū)嶒炇夷軌蛱峁┪募C據(jù)證明其相關(guān)特性沒有改變。工作菌株不可代替標準菌株。標準菌株的商業(yè)衍生物僅可用作工作菌株。第46頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四抽（采）樣采樣與樣本運輸針對不同疾病和檢驗目的制訂詳細的采樣計劃和方案，包括采樣時間、對象、樣本種類、方法、標識、包裝運輸、實