肝損傷時的抗氧化防御機制

、前言肝臟是人體最大的實質(zhì)性器官，執(zhí)行大量的新陳代謝的功能，是藥物和其他異物如殺蟲劑主要的代謝器官。這些功能的實行需要線粒體中很多的有氧代謝來提供足夠量的三磷酸腺苷（ATP。然而，這種代謝過程可不斷產(chǎn)生一些氧化活性物質(zhì)（reactiveoxygenspecies，ROS。）除此之外，藥物的代謝和炎癥時細(xì)胞的損傷能明顯地增加細(xì)胞與器官氧化應(yīng)激的負(fù)擔(dān)。本篇重點討論活性氧和過氧化硝酸鹽的形成，介紹不同細(xì)胞和血管腔隙中抗氧化系統(tǒng)，并分析肝臟中過多的氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的不良后果。、活化氧和氮的中間產(chǎn)物氧分子可以通過一個電子的轉(zhuǎn)移生成超氧化物（02-），過氧化氫（H2O2），羥自由基（OH.）,然后可以生成水。超氧化物不穩(wěn)定，可在超氧化物歧化酶的作用下快速生成過氧化氫和單價氧分子，以及另一個ROS然而，在一氧化氮中，超氧化物易跟一氧化氮反映，生成過（氧化）亞硝酸鹽。過（氧化）亞硝酸鹽生成的比率取決于一氧化氮和超氧化物（一級動力學(xué)）的濃度，這個反應(yīng)傾向于擴散控制。在生物體內(nèi)，由于二氧化碳和碳酸氫根的普遍存在，過（氧化）亞硝酸鹽根二氧化碳快速反應(yīng)，生成反應(yīng)中間體，這些中間體是可以高效的氧化和硝化的物質(zhì)。除此之外，過（氧化）亞硝酸鹽可以經(jīng)過質(zhì)子化生成過氧乙酸，過氧乙酸是很強的氧化劑。過氧化氫可以與過渡態(tài)金屬發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成羥基（芬頓反應(yīng)）。然而，如果吞噬細(xì)胞釋放髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO，）次氯酸就會產(chǎn)生，次氯酸也是一種強力氧化劑。除了一些被發(fā)現(xiàn)的活性中間體，一些次要的自由基也可以形成，如烷基、過氧自由基和烷氧自由基。一般而言，在反應(yīng)中，次要的自由基反應(yīng)活性低且有更多的選擇性。在機體中，這些活性氧和氮的形成和濃度的穩(wěn)定取決于很多因素，包括：前體的形成率，解毒反應(yīng)，酸堿度和過渡金屬的可利用性。、細(xì)胞內(nèi)和血管中氧化劑的來源線粒體所有的肝細(xì)胞和脈管產(chǎn)生的主要的初始氧化活性物質(zhì)就是超氧化物和過氧化氫。細(xì)胞內(nèi)一種主要的連續(xù)的超氧化物形成的來源就是：線粒體中的電子傳遞鏈。每個細(xì)胞中約有2%的氧用來產(chǎn)生超氧化物。即使在生理條件下，還原型輔酶I脫氫酶（復(fù)合體1）和泛醌-細(xì)胞色素b復(fù)合體（復(fù)合體3）也能釋放超氧化物。研究發(fā)現(xiàn)，在緩慢的安靜狀態(tài)下，每分鐘呼吸四次，線粒體中超氧化物的形成最多話句話說，當(dāng)呼吸鏈中的組分主要處于簡化形式時，超氧化物的形成最多。當(dāng)線粒體受損時，線粒體中的超氧化物可以明顯增加。當(dāng)超氧化物從電子傳遞鏈中釋放出來時，它可以和一氧化氮反應(yīng)生成過（氧化）亞硝酸鹽。據(jù)推測，線粒體中包含一氧化氮合成酶（NOS）。然而，是否真的存在一氧化氮合成酶還是個問題。不過，當(dāng)一氧化氮從線粒體外擴散進線粒體時，線粒體中也可以形成過（氧化）亞硝酸鹽。除了位于線粒體內(nèi)膜的電子傳遞鏈，位于外膜上的單胺氧化酶也可以產(chǎn)生一定量的過氧化氫，它是通過生物胺的氧化脫氨作用產(chǎn)生的。由于定位的關(guān)系，單胺氧化酶對線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)的氧化應(yīng)激具有重要的貢獻(xiàn)。已證實，線粒體的氧化應(yīng)激與它在某種情況下的功能異常有關(guān)：如缺血再灌注，化學(xué)缺氧，細(xì)胞外的氧化應(yīng)激，乙醇的毒性和膽汁酸。在對乙酰氨基酚肝毒性中，活性氧和過(氧化)亞硝酸鹽在線粒體中形成。微粒體在異源性物質(zhì)I相代謝的過程中，微粒體中的細(xì)胞色素P450酶類系統(tǒng)可以釋放活性氧中間體。有資料顯示，分離出的微粒體可以產(chǎn)生過氧化氫和超氧化物。然而，藥物代謝的體內(nèi)實驗很少能證實氧化應(yīng)激的增加，說明體內(nèi)完整的細(xì)胞中細(xì)胞色素P450酶類和分離出的微粒體相比，產(chǎn)生的氧化活性物質(zhì)比較少。另一方面，細(xì)胞色素P4502E1是肝臟中乙醇代謝時，產(chǎn)生氧化活性物質(zhì)的主要來源。此外，肝臟中的藥物代謝可以引起二次氧化應(yīng)激，例如，損傷線粒體和影響過渡態(tài)金屬的動員。一種嚴(yán)重的氧化應(yīng)激可以通過氧化還原因子的代謝產(chǎn)生，如敵草快，百草枯，維生素K。這些化合物質(zhì)可以通過細(xì)胞色素P450還原酶轉(zhuǎn)化為一種基礎(chǔ)的物質(zhì)，從而可以為氧轉(zhuǎn)化為超氧化物提供原始材料。氧化還原循環(huán)的因子在被排泄和產(chǎn)生強大的氧化應(yīng)激前，可以經(jīng)歷很多的循環(huán)，使肝臟嚴(yán)重受損。過氧化物酶體過氧化物酶體包括很多的氧化酶，例如，脂肪酸?；o酶A氧化酶，氨基酸氧化酶和尿酸氧化酶，它們的主要作用就是產(chǎn)生過氧化氫。這是因為在過氧化物酶體中有很多過氧化氫酶，在生理條件下，對其不利的影響很少。然而，高脂飲食和藥物這些過氧化物酶體增值劑可以引起脂肪酸?；o酶 A氧化酶的增加，并增加細(xì)胞器中氧化應(yīng)激的可能性。胞漿黃嘌吟脫氫酶是所有肝細(xì)胞的胞漿中主要的酶。雖然在肝臟的三種細(xì)胞中，這種酶的活性是一樣的，但是肝細(xì)胞包含了大于85%的該種酶的總活性。長期的缺血和某些藥物可以引起該酶的蛋白水解，導(dǎo)致結(jié)合輔酶煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(NAD的能力降低。相反，這種酶可以起到氧化酶的活性，它通過把氧分子作為電子接受體，這樣可以在胞漿中產(chǎn)生超氧化物和過氧化氫。不久前，黃嘌吟脫氫酶(X0)被認(rèn)為是在缺血再灌注時的細(xì)胞內(nèi)活性氧形成的主要來源。然而，在肝細(xì)胞中，黃嘌吟脫氫酶(X0)是否可以產(chǎn)生一定量的相關(guān)的氧化應(yīng)激得到質(zhì)疑。在培養(yǎng)基中，限制黃嘌吟或次黃嘌吟的供應(yīng)，可能是黃嘌吟脫氫酶(X0)相關(guān)的活性氧形成持續(xù)性和程度的限制性因素。這說明黃嘌吟脫氫酶(X0)可能是枯否細(xì)胞中活性氧的一個來源，當(dāng)它被肝細(xì)胞釋放時，就和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合在一起，成為血管內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激的主要來源。血管的氧化應(yīng)激枯否細(xì)胞激活和肝臟中的中性粒細(xì)胞募集可在下列情況下發(fā)生：藥物代謝，缺血再灌注，內(nèi)毒素血癥，酒精性肝炎和阻塞性膽汁淤積癥，這可能會引起肝損傷。許多炎性介質(zhì)被激活，包括激活的補體因子、腫瘤壞死因子和血小板活性因子，枯否細(xì)胞也被激活，中性粒細(xì)胞被招募，用來增強超氧化物的形成，枯否細(xì)胞的位置是固定的，它位于竇狀小管內(nèi)?？莘窦?xì)胞中還原型輔酶u (NADPH氧化酶產(chǎn)生的超氧化物，被釋放到竇狀小管內(nèi)和竇周隙。因為和其它細(xì)胞挨得很近，枯否細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧可以直接引起細(xì)胞損傷，血管的抗氧化劑可以抑制這種現(xiàn)象。與枯否細(xì)胞相比，附于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的中性粒細(xì)胞只有在過度刺激時才會產(chǎn)生細(xì)胞毒性介質(zhì)。然而，在機體的病理生理中，這種現(xiàn)象罕見發(fā)生。當(dāng)發(fā)生趨化刺激、遷移，中性粒細(xì)胞粘附到肝細(xì)胞后，才會引起損傷。這個過程需要很多的粘附分子，包括：B2整合素和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)。B2整合素Mac-1(CD11b/CD18)的上調(diào)與跟這個受體的粘附性是中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧的關(guān)鍵因素。每個中性粒細(xì)胞引發(fā)的肝損傷中都可見到Mac-1的表達(dá)，這種現(xiàn)象證實了上述假說。此外，加入Mac-1的抗體，中性粒細(xì)胞引起的缺血后氧化應(yīng)激明顯減低，抑制中性粒細(xì)胞引發(fā)的肝損傷。還有，在 CD18基因敲除的小鼠中，當(dāng)患上阻塞性膽汁淤積癥或者用萘基異氰酸酯處理時，中性粒細(xì)胞誘發(fā)的氧化應(yīng)激和引起的損傷是明顯降低的?；罨踉谥行粤＜?xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷中的作用機制還不清楚。共培養(yǎng)系統(tǒng)顯示：在體外，超過15小時，活化的中性粒細(xì)胞通過蛋白酶的釋放引起肝細(xì)胞損傷，而不是通過氧化應(yīng)激。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)：通過遷移和中性粒細(xì)胞粘附所產(chǎn)生的活化氧，不僅可以引起脈管系統(tǒng)內(nèi)的氧化應(yīng)激，在細(xì)胞內(nèi)也可以引起。在中性粒細(xì)胞毒性中，3-氯酪氨酸蛋白加合物和改造的次氯酸蛋白決定簇的出現(xiàn)證明在目標(biāo)細(xì)胞中，中性粒細(xì)胞衍生的氧化劑的存在。此外，在谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)基因敲除的小鼠中，對中性粒細(xì)胞毒性的高敏感性說明：中性粒細(xì)胞可以通過活化氧殺傷肝細(xì)胞，這個過程發(fā)生在中性粒細(xì)胞侵襲不到一小時的時候。我們怎么解釋體內(nèi)試驗和體外培養(yǎng)系統(tǒng)中結(jié)果的明顯不同呢？對這種相反的結(jié)果的最可能的解釋就是：肝細(xì)胞的作用不同。在體內(nèi)，當(dāng)中性粒細(xì)胞引起趨化因子細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的上調(diào)，形成和釋放CXC趨化因子的時候，肝細(xì)胞暴露在相同的炎性介質(zhì)中。趨化因子和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)對中性粒細(xì)胞的趨化和粘附在肝細(xì)胞上起重要的作用，這是中性粒細(xì)胞脫顆粒和長期持續(xù)的活化因子形成的最后激活步驟。相比之下，所有的控制肝臟細(xì)胞的共培養(yǎng)實驗都做了。既然中性粒細(xì)胞不侵襲正常的細(xì)胞，它們在機體中并不是穩(wěn)固的粘附，它們的毒性取決于炎性因子過度的刺激。雖然活性氧可能會產(chǎn)生，但它可能不夠引起毒性，不易接近肝細(xì)胞。因此，體外的細(xì)胞毒性可能是有蛋白酶的緩慢消化引起的，而不是因為活性氧的快速的定向攻擊。四、氧化應(yīng)激的病理生理結(jié)果.脂質(zhì)過氧化肝細(xì)胞中的氧化應(yīng)激可以引起脂質(zhì)過氧化(LPO),這是引起細(xì)胞損傷的較常見的機制。然而，在定量的基礎(chǔ)上，機體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化 (LPO)還不足以引起直接的細(xì)胞死亡。在細(xì)胞內(nèi)，單獨的過量的超氧化物形成通過脂質(zhì)過氧化(LPO)也不足以殺傷肝細(xì)胞，即使在谷胱甘肽耗竭的情況下。除了活化氧形成外，體內(nèi)肝臟中過多的脂質(zhì)過氧化(LPO)被發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在下列情況下：細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑如維生素E和谷胱甘肽（GSH）耗竭，胞膜中出現(xiàn)大量的多不飽和脂肪酸，還有就是鐵從細(xì)胞內(nèi)的儲存庫中被動員。如果這些因素一起出現(xiàn)，過量的脂質(zhì)過氧化（LPO）就會引起嚴(yán)重的細(xì)胞損傷。然而，在很多病理生理情況下，脂質(zhì)過氧化 （LPO）是很少的，直接引起細(xì)胞損傷的可能性不大。這是不是就意味著脂質(zhì)過氧化（LPO）不重要？脂質(zhì)過氧化（LPO）產(chǎn)物是中性粒細(xì)胞強有力的趨化因子，可以調(diào)節(jié)超氧化物的形成。此外，脂質(zhì)過氧化（LPO）產(chǎn)物可能增加趨化因子的形成。這些發(fā)現(xiàn)可以解釋除了原先的調(diào)節(jié)因子的形成外，脂質(zhì)過氧化（LPO）產(chǎn)物在控制炎癥反應(yīng)中的作用。此外，在活化的星狀細(xì)胞中，脂質(zhì)過氧化（LPO）產(chǎn)物促進膠原蛋白基因的表達(dá)，并可以誘發(fā)纖維化。因此，在某些病理生理情況系，脂質(zhì)過氧化（LPO）產(chǎn)物可能是重要的信號分子。2.過（氧化）亞硝酸鹽的形成過（氧化）亞硝酸鹽跟二氧化碳反應(yīng)生成硝化產(chǎn)物，繼而又和酪氨酸發(fā)生反應(yīng)。在對乙酰氨基酚肝毒性期間，在線粒體中，一種線粒體中的氧化應(yīng)激可以跟一氧化氮在誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的作用下合成過（氧化）亞硝酸鹽。當(dāng)胞漿和線粒體中的谷胱甘肽（GSH）被大量消耗時，過（氧化）亞硝酸鹽被認(rèn)為是細(xì)胞損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，減少過（氧化）亞硝酸鹽，不僅可以減少細(xì)胞死亡，還能促進細(xì)胞循環(huán)活化與增殖。雖然，詳細(xì)的機制沒有完全搞清楚，過（氧化）亞硝酸鹽被認(rèn)為在線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換（MPT）轉(zhuǎn)運孔的開放中起作用。膜通透性轉(zhuǎn)換（MPT）破壞線粒體中的膜電位，引起ATP的耗竭，釋放膜間隙蛋白，如：核酸內(nèi)切酶G和凋亡誘導(dǎo)因子，它們可以進入細(xì)胞核，進而使DNA斷裂。這些足以說明對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的壞死的發(fā)展過程。在肝臟的缺血再灌注損傷中，肝臟中可以檢測到硝基酪氨酸殘基，在酒精性肝病中也可發(fā)現(xiàn)，但是相關(guān)的病理生理過程還不清楚。既然缺血應(yīng)激能促進肝臟脈管系統(tǒng)的血管收縮，肝臟中一氧化氮形成物對肝臟的血流也起到重要的作用。在很多情況系，過氧化亞硝酸鹽的形成，尤其是“清道夫”因子如谷胱甘肽（GSH），還原型輔酶U（NADPH的出現(xiàn)，可以減少長期的血管收縮和缺血引起的損傷。3?活性氧和細(xì)胞死亡在沒有脂質(zhì)過氧化（LPO）損傷的情況下，活性氧可以引起肝細(xì)胞壞死。這種細(xì)胞壞死的機制跟膜通透性轉(zhuǎn)換（MPT）中，轉(zhuǎn)運孔的開放有關(guān)，它可以引起線粒體解耦聯(lián)和丟失很多膜電位。顯著的氧化應(yīng)激可以使線粒體中的毗啶核苷酸發(fā)生氧化作用，并誘導(dǎo)線粒體中氧化活性物質(zhì)（ROS）的形成，這兩種反應(yīng)都可以增加線粒體中游離的鈣離子。膜通透性轉(zhuǎn)換（MPT）可以由線粒體中增加的鈣離子直接誘導(dǎo)產(chǎn)生，也可以通過線粒體中絲氨酸蛋白酶（鈣蛋白酶）的活化誘導(dǎo)。胞漿中的鈣蛋白酶可以通過破壞細(xì)胞骨架蛋白誘導(dǎo)胞膜毒性。這些反應(yīng)可以在一小時內(nèi)導(dǎo)致肝細(xì)胞迅速壞死?；钚匝跻部梢酝ㄟ^細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在維生素K誘導(dǎo)下產(chǎn)生的超氧化物，依賴于促細(xì)胞分裂原活化蛋白激酶（MAPK信言號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞凋亡途徑，在肝細(xì)胞系和原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞中都可以誘發(fā)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1/2）可以減弱超氧化物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。與超氧化物相比，高水平的過氧化氫可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死。當(dāng)過氧化氫暴露后，凋亡減少的原因可能是：高濃度的過氧化氫誘發(fā)了半胱氨酸蛋白酶的氧化抑制劑。這種機制可能可以解釋在一個炎癥點，雖然有活化的中性粒細(xì)胞，但發(fā)生凋亡延遲。此外，既然只有中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的過氧化氫和次氯酸可以通過細(xì)胞膜，誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，這就可以解釋，為什么中性粒細(xì)胞可以引起細(xì)胞壞死而不能引起細(xì)胞凋亡。4.活化氧和基因轉(zhuǎn)錄許多轉(zhuǎn)錄因子的活化可以被氧化活性物質(zhì)(ROS誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)，如核因子NFKB和活化蛋白1(AP-1)。盡管有很多的實驗數(shù)據(jù)，這些轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原敏感性的分子機制還是不完全清楚。然而，這些轉(zhuǎn)錄因子中很多都有硫醇，硫醇對轉(zhuǎn)錄因子的活化其關(guān)鍵作用，已知硫醇至少是部分被硫氧化還原蛋白(Trx)所調(diào)節(jié)的。前炎癥細(xì)胞因子(如：腫瘤壞死因子 a,白介素1),趨化因子仗□白介素8),粘附分子(如細(xì)胞間粘附分子-1,血管細(xì)胞粘附分子-1,內(nèi)皮細(xì)胞選擇素)和應(yīng)激基因(如血紅素加氧酶1)被這些敏感的氧化還原轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。因此，活化氧可以明顯的加劇炎癥反應(yīng)繼而直接引起細(xì)胞損傷。在肝臟中，氧化應(yīng)激可以調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子a的形成?？寡趸瘎┮种苾?nèi)毒素誘導(dǎo)的核因子NFKB的活性，腫瘤壞死因子a信使RNA的形成，還抑制孤立的枯否細(xì)胞中蛋白質(zhì)的形成。為了證實這些結(jié)論，機體中的腫瘤壞死因子a的形成可以被清道夫二甲基亞砜抑制，而且，在谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)敲除的小鼠模型中， 內(nèi)毒素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子a的產(chǎn)生增加了3倍。此外，從用酒精處理的動物中分離出來的肝巨噬細(xì)胞中，暴露于內(nèi)毒素后，非血紅素鐵含量和增加的活化氧形成物產(chǎn)生增加，還有高水平的核因子NFKB活化和細(xì)胞因子及趨化因子的轉(zhuǎn)錄增加。這些資料可以清楚地說明：枯否細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄可以被活化氧所調(diào)節(jié)。然而，不僅前炎性基因，拮抗氧化應(yīng)激的基因也可以通過氧化活性物質(zhì) (ROS)而激活?？偟膩碚f，這些基因的啟動子中含有抗氧化反應(yīng)元件(ARE)?？寡趸磻?yīng)元件(ARE)通過轉(zhuǎn)錄因子NF-E2依賴的因子Nf2來調(diào)節(jié)，Nf2是從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的。Nf2與胞漿抑制劑相關(guān)聯(lián)，即胞漿中的環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)。當(dāng)Keapl中的硫醇被氧化時，Nrf2就會被釋放，并進入細(xì)胞核。用對乙酰氨基酚處理后，Nf2就會活化，它可能是通過上調(diào)血紅素加氧酶1(HO-1)和其它一些保護基因來抑制肝細(xì)胞的損傷。在失血性休克及復(fù)蘇過程中，肝細(xì)胞中血紅素加氧酶1(HO-1)的誘導(dǎo)依賴于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AP-1的活性?？寡趸瘎┘瓤梢砸种妻D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AP-1的活性，又可以抑制血紅素加氧酶1(HO-1)的誘導(dǎo)。血紅素加氧酶1(HO-1)可以產(chǎn)生膽綠素抗氧化劑和血管擴張劑一氧化碳，二者可能都可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞中的保護性因子血紅素加氧酶1(HO-1)的產(chǎn)生。肝星狀細(xì)胞調(diào)節(jié)肝竇區(qū)中的血流量，經(jīng)過后期轉(zhuǎn)換，成為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的主要來源，繼而引發(fā)肝纖維化。這就可以解釋為什么活化氧和脂質(zhì)過氧化(LPO)可以引起纖維化的產(chǎn)生。在體內(nèi)，氧化活性物質(zhì)(ROS)可以誘導(dǎo)或者調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子B1誘導(dǎo)的膠原蛋白al基因的表達(dá)。此外，活化氧可以刺激肝星狀細(xì)胞中趨化因子的轉(zhuǎn)錄，從而增強抗炎癥反應(yīng)。雖然有足夠的證據(jù)證明，在肝細(xì)胞中，氧化活性物質(zhì)(ROS)可以直接引起細(xì)胞死亡，或者說可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性和基因的表達(dá)，但是應(yīng)該謹(jǐn)記，很多的關(guān)于氧化活性物質(zhì)(ROS)的毒性和氧化還原反應(yīng)的調(diào)節(jié)是通過細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果得到的。當(dāng)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞被孤立出來時，其基因表達(dá)譜馬上就會發(fā)生改變，與機體中完整的肝臟有明顯的不同。既然培養(yǎng)的肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激取決于過多的氧，對這些人工培養(yǎng)條件下做出的適應(yīng)性改變可能調(diào)節(jié)對氧化應(yīng)激的敏感性，進而激發(fā)氧化還原調(diào)節(jié)的信號途徑，而在機體中，這些可能會受到限制。五、抗氧化防御系統(tǒng)在肝細(xì)胞的生理功能期，活化氧和活化的氮類物質(zhì)不斷的產(chǎn)生，在許多病理情況下，很多潛在的氧化應(yīng)激大幅度增加，這就需要一種有效的防御系統(tǒng)來抵制這些活性中間體。因為氧和氮的代謝產(chǎn)物有很多種，還有它們的定位和活性都不同，這就需要在肝臟中有一種復(fù)雜的多層次的抗氧化酶類網(wǎng)絡(luò)和小分子執(zhí)行功1.酶促防御機制在大部分細(xì)胞之間，超氧化物是通過超氧化物歧化酶 （SODs）轉(zhuǎn)移的。Cu2+/Zn2+-超氧化物歧化酶（SOD1）主要位于胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，Mn3+-SOD（SOD2）主要位于線粒體。超氧化物首先跟有氧化還原活性的金屬（如Cu2+或者Mn3+）反應(yīng)生成氧分子；然后超氧化物分支跟金屬離子反應(yīng)生成過氧化氫。超氧化物在超氧化物歧化酶的作用下發(fā)生的反應(yīng)就有擴散限制的特征。細(xì)胞內(nèi)高水平的超氧化物歧化酶（約10口可以維持超氧化物在一個穩(wěn)定的水平1到10pM既然超氧化物本身并不是很強的毒性分子，它自發(fā)的歧化反應(yīng)也有相同的反應(yīng)產(chǎn)物。但為什么有高水平的超氧化物歧化酶卻有好處呢？事實證明，超氧化物歧化酶催化的歧化反應(yīng)可以避免氧分子的產(chǎn)生，超氧化物歧化酶的重要性可能是，它可能能限制過（氧化）亞硝酸鹽的產(chǎn)生?？匆幌卵趸锲缁福?.4X109/M/sec）和一氧化氮（2X1010/M/sec）對超氧化物催化的反應(yīng)速率，超氧化物消失的速度：跟SOD（1QxM）是20000/sec，跟一氧化氮（10nM在生理情況下測量的）是200/seCo因此，在生理情況下，SOD可以防止過氧化亞硝酸鹽的形成。然而，如果在炎癥反應(yīng)中，NO濃度增加（10PM）,超氧化物跟NO的反應(yīng)速率會增加到40000/seco這說明：在炎癥條件下，SOD不能防止細(xì)胞內(nèi)過氧化亞硝酸鹽的形成。在細(xì)胞外，當(dāng)SOD水平很低時，這種情況更關(guān)鍵。經(jīng)超氧化物歧化酶形成的化合物的降解是通過觸酶，谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）或者過氧化氫酶。很多觸酶都是在過氧化物酶體中發(fā)揮活性的。哺乳動物的觸酶是一種血紅素蛋白，它可以利用從過氧化氫或者其它小分子如乙醇或甲醇獲得的電子吧過氧化氫轉(zhuǎn)化成水（過氧化物酶反應(yīng)）。在肝臟中，觸酶可以被下列情況誘導(dǎo)產(chǎn)生：熱能限制，鎮(zhèn)靜安眠劑，降血脂藥物如心血平。觸酶的主要作用就是代謝掉在過氧化氫酶體中經(jīng)氧化酶產(chǎn)生的過氧化氫。只有在極端條件下，部分過氧化氫能逃脫過氧化氫酶體，大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫可以不經(jīng)觸酶脫毒。細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶（cGPx-1）是四種已知的硒依賴的谷胱甘肽過氧化物酶體之一，它被廣泛表達(dá)。其它三種包括： GPx-2（胃腸中的谷胱甘肽過氧化物酶），GPx-3（血漿中的谷胱甘肽過氧化物酶），GPx-4（磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶）。75%勺cGPx-1存在于胞漿中，25烷在于線粒體中。這種酶中的硒以硒代半胱氨酸的形式存在，它在酶的催化功能中起重要的作用。cGPx-1可以減少過氧化物，包括過氧化氫和有機過氧化物。雖然有證據(jù)證明，在體外，cGPx-1可以減少過（氧化）亞硝酸鹽，但是，在cGPx-1基因敲除的小鼠中，對乙酰氨基使用過量引起的過（氧化）亞硝酸鹽依賴的損傷并未增強。相比來說，它對過氧化物底物具有低特異性，這種酶需要GSH（還原型谷胱甘肽）作為輔因子。谷胱甘肽（GSSG在谷胱甘肽還原酶和NADPH勺作用下很快被還原為GSH既然還原酶是這個循環(huán)的限速酶，GSSGH累到一定程度可以被分泌至膽汁和血漿。GSSG可以通過還原酶（大于95%）清除，還有部分（小于5%）排出肝細(xì)胞，高水平的GSSGT以通過氧化作用保護巰基。線粒體可以攝入和釋放GSH但不能輸出GSSG因此，線粒體中唯一預(yù)防GSSGK累的方法就是減少GSS。的生成。至于對乙酰氨基酚的毒性，是不能總是避免的。據(jù)發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST-B）家族的一個成員是在硒缺乏的小鼠中參與活化GPx的一種酶。當(dāng)硒缺乏時能誘導(dǎo)產(chǎn)生GST-B它只能代謝有機過氧化物，而不能代謝過氧化氫。然而，盡管有一定的適應(yīng)，硒缺乏的動物還是比較容易發(fā)生活化氧誘導(dǎo)的肝損傷。還發(fā)現(xiàn)，另一種酶GPx-4可以選擇性地利用脂質(zhì)過氧化物作為底物。這種酶存在于線粒體、細(xì)胞核和微粒體，它還參與過氧化脂質(zhì)代謝繼而抑制LPO的增值。.硫氧化還原蛋白和過氧化還原蛋白在很多哺乳動物的細(xì)胞中，硫氧化還原蛋白1（Trx-1）存在一細(xì)胞的胞漿中，但經(jīng)常在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)它，尤其是核質(zhì)中。Trx-2主要在線粒體中被檢測到。Trx包含具有氧化還原活性的二硫鍵，它可以被氧化成相應(yīng)的二硫化產(chǎn)物。Trx-1和Trx-2的氧化形式被相應(yīng)的硫氧化還原蛋白還原酶 1（TR1）和（TR2）所還原。這些酶的很多功能都已經(jīng)被報道過，E艮GSH/GP系統(tǒng)互補。Trx的一個重要的功能就是逆轉(zhuǎn)氧化反應(yīng)，減少蛋白質(zhì)二硫化物。這些功能不僅可以保持蛋白質(zhì)的功能，還可以調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性。Trx通過減少關(guān)鍵的二硫鍵，可以在核易位后增加DNA對NFKB和AP-1的綁定。Trx可以發(fā)揮抗氧化劑的功能，減少過氧化氫和過（氧化）亞硝酸鹽。然而，這需要Trx和Prxs（過氧化還原蛋白）同時發(fā)揮作用。哺乳動物的細(xì)胞中表達(dá)至少6種Prx亞型（PrxI-VI）。Prx1,11,和VI存在于胞漿中，PrxIII和V存在于線粒體中，PrxIV則位于細(xì)胞外。通常，Prx家族的成員的氮末端都有一個保守的半胱氨酸殘基，這個殘基就是最初的被過氧化氫氧化的半胱氨酸部位。在這個反應(yīng)中，半胱氨酸巰基（cys-SH）被氧化為中間產(chǎn)物次磺酸（cys-SOH）,然后cys-SOH被第二種半胱氨酸殘基氧化為二硫化物（Prx-S-S-Prx）。這種二硫化物可以被Trx還原。正是因為胞漿中有高濃度的Prx,Prx/Trx系統(tǒng)清除低水平的過氧化氫的效率甚至高于 GPx/GS瘵統(tǒng)。然而，在某些情況下，Prx-SOH可以被氧化為亞磺酸形式（Prx-SO2H），而Prx-SO2H就不能被Trx還原。Prx可以被另一種酶（硫氧還原蛋白酶）清除，然而，這個反應(yīng)很慢。因此，超氧化物可以引起Prx暫時性失活，繼而導(dǎo)致過氧化氫聚集并實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。.低分子量的抗氧化劑抗壞血酸鹽（vitaminC），生育酚（vitaminE）和GSH都是低分子量的抗氧化劑。生育酚是生物體細(xì)胞膜最強的鏈斷裂化合物。然而，跟許多抗氧化劑一樣，生育酚在體內(nèi)的濃度并不高，不能清除相應(yīng)的羥自由基。但是，它可以有效地把羥自由基轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)過氧化物，然后被GPx-4代謝，這是一個比較次要的反應(yīng)。因此，生育酚可以通過新的烷基自由基的形成來阻止自由基鏈的延伸。抗壞血酸鹽的形成是一個加水的過程，它可以通過兩種酶形成， GSH依賴的脫氫抗壞血酸還原酶和NADH依賴的半脫氫抗壞血酸還原酶。因此，低分子量的抗氧化劑可以一起作用，干擾自由基鏈反應(yīng)，把自由基從敏感區(qū)轉(zhuǎn)移出去，如：從疏水膜轉(zhuǎn)移到親水區(qū)。在對乙酰氨基酚肝毒性中，這些化合物作為防御系統(tǒng)來保護胞膜的重要性已被證實。在體內(nèi)，除了大量的線粒體氧化應(yīng)激和過氧化亞硝酸鹽的形成，LPO并不是這種藥物引起細(xì)胞損傷的機制。然而，當(dāng)用生育酚缺乏的食物喂養(yǎng)動物時，在對乙酰氨基酚控制之后的1到4小時，LPO成為肝臟破壞的主要損傷機制。GSH是最重要的可溶于水的抗氧化劑。它是GPxs和GSTs的輔因子，在維持巰基蛋白質(zhì)的穩(wěn)定中也起重要的作用。GSH也是過（氧化）亞硝酸鹽和HOCI的清道夫。GSHt起關(guān)鍵作用的就是半胱氨酸的巰基，這個基團發(fā)生自動氧化的能力不及在單獨的氨基酸中的巰基。GSH在細(xì)胞內(nèi)通過兩種ATP依賴的酶合成：丫谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶。因為它有抗蛋白酶丫谷氨酰結(jié)構(gòu)，GSH不能被細(xì)胞內(nèi)的抗蛋白酶降解。因此，為了細(xì)胞的正常運行， GSH只能被轉(zhuǎn)運出細(xì)胞從而被谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶降解，這種酶存在于下列器官的上皮細(xì)胞表面：腎，肺，腸和膽道。血漿中約90%勺GSH是由肝臟中的竇狀小管釋放提供的。與GSH俞出相關(guān)的蛋白包括多藥耐藥相關(guān)蛋白（Mrps）（它們是ATP1聯(lián)盒式超家族成員）和有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（Oatps）oMrps利用ATPOatps利用電化學(xué)梯度作為驅(qū)動力。在小管膜中，Mrp2是GSH的主要載體。Oatp1和Oatp2在竇狀小管膜GSH的輸出中發(fā)揮重要作用。Mrp4位于基底外側(cè)膜，可以協(xié)同運輸GSH和膽汁酸。除了GSH的膽道出口，Mrp2可以作為GSSG和GSH軛合物主要載體。關(guān)于竇狀小管中的GSSG勺轉(zhuǎn)運知道的很少。然而，功能性研究顯示：在離體肝臟和體內(nèi)研究中，都可以看到GSSGA釋放到竇狀小管中。即使在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激時，也是定量的（大約1%八5%GSS周%成物被釋放，其它的95%八99%被谷胱甘肽還原酶還原。釋放的GSS防，接近80%被釋放到膽汁，另外20%被釋放到竇狀小管。因此，膽汁中的GSSG勺排泄是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的敏感性標(biāo)志。GSH不僅存在于胞漿中，也存在于其它的細(xì)胞器如線粒體中（含細(xì)胞中GSH的15%o然而，GSH并不是在線粒體中合成，而是從胞漿中轉(zhuǎn)運過來的。這個過程的載體包括二羧酸和2-酮戊二酸載體，它們存在于線粒體內(nèi)膜中。GSH轉(zhuǎn)運到線粒體基質(zhì)是逆著電化學(xué)梯度的，這個過程借助于磷酸鹽（二羧酸載體）和酮戊二酸（酮戊二酸載體）的協(xié)助完成。線粒體中GSH的耗竭可損害該細(xì)胞器解毒機制，增加氧化損傷，引起線粒體功能喪失，進而引起細(xì)胞死亡。線粒體中的活化氧溢出可以誘導(dǎo)NFKB活化，并促進基因轉(zhuǎn)錄。另一方面，線粒體中通過GPx產(chǎn)生的任何形式的GSSGA不能輸出到胞漿；因此在對乙酰氨基酚毒性期間，GSSG勺產(chǎn)生不得不減少，否則它就會聚集。4.金屬結(jié)合蛋白自由基的抗氧化過程如LPO依賴于可利用的氧化還原態(tài)的過渡金屬。因此，另一種預(yù)防措施就是保持金屬離子如Fe2+/Fe3+或者Cu+和轉(zhuǎn)運、儲存蛋白緊密的結(jié)合。金屬結(jié)合蛋白包括：鐵蛋白，鐵轉(zhuǎn)運蛋白，乳鐵蛋白鐵，銅藍(lán)蛋白和其他金屬的金屬硫蛋白。正是因為它有很多的半胱氨酸，金屬硫蛋白可能直接或間接的表現(xiàn)出抗氧化劑的性質(zhì)。六、非實質(zhì)細(xì)胞中的抗氧化防御前面的段落描述了肝臟中的很多抗氧化策略，比如肝細(xì)胞中的抗氧化方法。然而，也有一些研究說明，在非實質(zhì)細(xì)胞中也有類似的系統(tǒng)發(fā)揮作用。一般來說，在非實質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞中，SODs和硒依賴的GPx的活性是一樣的。相似的，GSH在細(xì)胞蛋白中的含量基本是一致的，不管在哪種細(xì)胞中，都是 nmol/mg。然而，因為和肝細(xì)胞相比，非實質(zhì)細(xì)胞的體積很小，非實質(zhì)細(xì)胞中總的GSHA及肝臟中的5%因此，非實質(zhì)細(xì)胞對ROS勺脫毒能力只是肝細(xì)胞的很小的一部分。有趣的是，對同一種炎癥反應(yīng)，枯否細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的適應(yīng)性是不同的。發(fā)生內(nèi)毒素血癥時，枯否細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化途徑，從而增加超氧化物的形成。與此相反，內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)SODGPx葡萄糖轉(zhuǎn)運酶以及碳水化合物代謝的關(guān)鍵酶的活性。這些反應(yīng)說明：內(nèi)皮細(xì)胞具有對活化氧潛在的