保加利亞乳桿菌增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化和制備,生物技術(shù)論文

保加利亞乳桿菌增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化和制備,生物技術(shù)論文近年來,酸乳制品因其具有保健、長壽、美容以及醫(yī)藥應(yīng)用的效果而倍受消費(fèi)者青睞,市場前景特別廣闊.保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbul-garicus)是用于酸乳發(fā)酵的主要菌種之一,其通過發(fā)酵鮮奶產(chǎn)酸、產(chǎn)胞外多糖以及風(fēng)味物質(zhì),賦予酸奶獨(dú)特的風(fēng)味、良好的質(zhì)地和細(xì)膩的口感.同時,其具有調(diào)節(jié)人體胃腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)消化吸收、加強(qiáng)免疫功能、抗癌抗腫瘤等重要的生理保健功能,因此遭到更多人的關(guān)注.在酸乳生產(chǎn)中,開發(fā)高活性、低成本酸奶直投式發(fā)酵劑備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注,而該工作首先必須獲得能夠使乳酸菌快速生長的增菌培養(yǎng)基.乳酸菌增菌培養(yǎng)基的研究國內(nèi)外具有不同的方式方法.如程艷宇等人,通過優(yōu)化MRS培養(yǎng)基中Mg,Mn和Fe3種微量元素的配比,實(shí)現(xiàn)了保加利亞乳桿菌的增殖.劉海燕、呂加平等人使用番茄汁、胡蘿卜汁、啤酒等物質(zhì)對植物乳桿菌等乳酸菌進(jìn)行了增殖研究,并獲得了一定成果.安莉等人以17種氨基酸與牛乳的復(fù)合物為主要材料,研究了氨基酸對保加利亞乳桿菌生長的影響,證明絲氨酸、賴氨酸、亮氨酸與牛乳復(fù)合時對保加利亞乳桿菌促生長作用明顯.ClaireL.V.、周景欣等人經(jīng)過體外試驗(yàn)、臨床研究發(fā)現(xiàn),低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖等對人體腸內(nèi)乳酸桿菌均有明顯的增殖作用.另有研究者利用保加利亞乳桿菌發(fā)酵不同蔬菜來研究蔬菜對其增殖的影響,獲得了一定的成果.本課題組前期從牛乳發(fā)酵劑中挑選獲得了能顯著降低羊乳膻味和改善羊乳質(zhì)地的發(fā)酵菌株,并對其凝固羊乳發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,通過添加嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌等適宜菌株研究了羊乳發(fā)酵的條件.本文采用保加利亞乳桿菌(LB)為試驗(yàn)菌株,以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ),通過PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方式方法,對7種碳源/益生元和8種氨基酸進(jìn)行了挑選,以期獲得影響LB增菌的碳源/益生元和氨基酸,為進(jìn)一步優(yōu)化保加利亞乳桿菌增菌培養(yǎng)基和制備直投式酸羊奶凍干發(fā)酵劑提供技術(shù)支撐.1、材料與方式方法1.1材料1.1.1菌種及培養(yǎng)基保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,LB),由本實(shí)驗(yàn)室前期分離挑選,適宜用于羊奶發(fā)酵.MRS培養(yǎng)基:青島高科園海博生物技術(shù)有限公司,液體培養(yǎng)基用于LB的活化,瓊脂培養(yǎng)基用于其計(jì)數(shù).LB發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖5.43g,蛋白胨0.98g,磷酸氫二鉀0.59g,蒸餾水100mL,pH值6.4~6.6.118℃滅菌15min.用于LB的基礎(chǔ)培養(yǎng).1.1.2主要試劑及儀器實(shí)驗(yàn)中各種糖類、氨基酸以及上述培養(yǎng)基中所用試劑均為生化試劑級.DH5000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱:天津市泰斯特儀器有限公司;SW-CJ-1F無菌操作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司;DH5000AB電手提式蒸汽壓力滅菌器:江陰濱江醫(yī)療器械廠;722型光柵分光光度計(jì):上海第三分析儀器廠;PB-10酸度計(jì):賽多利斯(北京)科技有限公司.1.2方式方法1.2.1菌種活化及培養(yǎng)MRS培養(yǎng)基經(jīng)118℃滅菌15min,放于冰箱備用.取保加利亞乳桿菌(LB)的凍干菌粉,在無菌條件下,以2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中,37℃下恒溫培養(yǎng)24h.鏡檢確定無雜菌,再重復(fù)轉(zhuǎn)接3次至活力穩(wěn)定,即可到達(dá)活化目的.1.2.2保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)采用PB設(shè)計(jì)進(jìn)行分類挑選,以LB發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為培養(yǎng)基,優(yōu)化碳源(乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、水蘇糖及菊糖7種)、氨基酸(羥脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及谷氨酸8種).以上實(shí)驗(yàn)接種量均為3%,35℃培養(yǎng)20h后,測定其pH、OD值及活菌數(shù).每組做3個平行,以活菌數(shù)為響應(yīng)值,確定最優(yōu)的碳源及氨基酸.1.2.3菌體濃度測定(1)活菌計(jì)數(shù)法:采用固體MRS培養(yǎng)基,梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法分別對LB進(jìn)行計(jì)數(shù).(2)分光光度法:取增菌培養(yǎng)液,以未接種的空白培養(yǎng)基為對照,采用可見光分光光度計(jì),在波長600nm下比色而得.1.2.4培養(yǎng)液pH值的測定采用PB-10酸度計(jì),室溫下直接測定發(fā)酵液pH值,每份3個平行.1.2.5碳源/益生元影響因子的挑選選取N=12的PB設(shè)計(jì),以葡萄糖(X1),乳糖(X2),低聚木糖(X3),低聚果糖(X4),低聚半乳糖(X5),低聚異麥芽糖(X6),水蘇糖(X7),菊糖(X8)8個因素為考察對象,并以活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值,各因素分別取高(+)、低(-)兩個水平,低水平設(shè)置為原始的培養(yǎng)條件,高水平是低水平的2倍,12次試驗(yàn)中,菌體均在35℃下培養(yǎng)20h后,測定其pH、OD及活菌數(shù),每組設(shè)3個平行.各個因素的編碼水平見表1所示.1.2.6氨基酸影響因子的挑選菌體的生長除了碳源外,還需要氨基酸、維生素等物質(zhì),它們能對菌體的生長起到一定的促進(jìn)作用.采用9因素兩水平、N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對羥脯氨酸(X1)、精氨酸(X2)、亮氨酸(X3)、絲氨酸(X4)、天冬氨酸(X5)、酪氨酸(X6)、谷氨酸(X8)、苯丙氨酸(X9)等進(jìn)行研究.華而不實(shí)(X7)是虛擬項(xiàng),以減少誤差.活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值,挑選出影響較大的因素.35℃下培養(yǎng)20h后,測定其活菌數(shù)及pH,每組設(shè)3個平行.各個因素的編碼水平見表2所示.2、結(jié)果與討論2.1碳源/益生元影響因子挑選結(jié)果分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3所示.OD和pH作為參考值,活菌數(shù)為響應(yīng)值.所示.結(jié)果顯示,各個因素對LB生長的影響強(qiáng)弱為:X1X8X4X6X2X5X7X3.華而不實(shí)X1(p=0.033)是影響LB生長的顯著因素,X4(p=0.091)、X8(p=0.061)均為重要因素.X1、X4、X8對LB生長影響均呈正效應(yīng)(如此圖1所示).上述結(jié)果中菊糖、低聚果糖對LB的增菌影響與周景欣、呂利軍等人的研究結(jié)果類似,均對乳桿菌具有增菌作用;葡萄糖、乳糖的增菌作用與史媛英的研究結(jié)果有差異,本實(shí)驗(yàn)中葡萄糖的影響愈加顯著,乳糖的作用較小且呈負(fù)效應(yīng)(T=-1.265),這種差異可能是菌種不同所導(dǎo)致.2.2氨基酸影響因子挑選結(jié)果分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表5所示,分析時以活菌數(shù)為響應(yīng)值.根據(jù)SAS軟件分析得到圖2,由圖2可知,剔除X7虛擬項(xiàng)后的八個因素,華而不實(shí)前三個因素即谷氨酸(X8)、羥脯氨酸(X1)和酪氨酸(X6),條帶較長,即對LB生長的影響較大.且X1、X6對響應(yīng)值Y呈正效應(yīng),而影響最大的X8則呈負(fù)效應(yīng)(T=-1.005),如此圖3所示.上述結(jié)果與安莉等人的研究結(jié)果不同,在本實(shí)驗(yàn)中絲氨酸、賴氨酸的影響相對于谷氨酸、羥脯氨酸和酪氨酸較小,且亮氨酸呈負(fù)效應(yīng).3、結(jié)論采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),從7種碳源/益生元和8種氨基酸中分別挑選出顯著影響保加利亞乳桿菌增殖的因子.結(jié)果表示清楚,葡萄糖、低聚果糖、菊糖、酪氨酸和羥脯氨酸等有利于保加利亞乳桿菌的生長,概率水平90%,且對菌體的累積呈正效應(yīng),華而不實(shí)影響最顯著的碳源為葡萄糖(p=0.033),概率水平谷氨酸的添加對保加利亞乳桿菌的生長有顯著的抑制作用,在直投式酸羊乳凍干發(fā)酵劑制備中其添加量遭到限制.以下為參考文獻(xiàn)：[1]吳祖芳,郭陽.發(fā)酵乳的功能與特性[J].中國乳品工業(yè),1994,22(5):216-220.[2]徐心軍,林金資.嗜酸乳桿菌的療效作用及其應(yīng)用[J].中國乳品工業(yè),1990,18(5):237-238,232.[3]程艷宇,李妍,劉曉輝,等.優(yōu)良保加利亞乳桿菌菌株的挑選及增殖培養(yǎng)[J].中國乳品工業(yè),2018,38(7):11-14.[4]萬紅兵,田洪濤,馬樂輝,等.保加利亞乳桿菌番茄復(fù)合汁增菌培養(yǎng)基的優(yōu)選研究[J].中國乳品工業(yè),2006,34(8):14-17.[5]劉海燕,徐幸蓮,盧士玲.Plackett-Burman(PB)優(yōu)化植物乳桿菌